Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами"

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами

Автор: Остерман Л.А.
Издательство: М.: Наука
Год издания: 1983
Страницы: 296
Читать: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
Скачать: isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu

Л.А.ОСТЕРМАН
ИССЛЕДОВАНИЕ
БИОЛОГИЧЕСКИХ
МАКРОМОЛЕКУЛ
ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ И РАДИОИЗОТОПНЫМИ МЕТОДАМИ
ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА» Москва 1983
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) — один из наиболее эффективных и широко распространенных в настоящее время методов фракционирования и очистки белков. Его используют как на завершающих стадиях эксперимента (аналитический вариант), так и при обработке исходного клеточного гомогена-та (препаративный вариант). Многие методические приемы, например приготовление гелей полиакриламида и агарозы, окраска белковых полос, элюция белков из гелей и др., роднят ИЭФ с электрофорезом белков, подробно рассмотренным в предыдущей книге [Остерман, 1981]. Фракционирование белков при ИЭФ производится в электрическом поле с помощью тех же приборов, которые используются для электрофореза. Ниже при изложении материала предполагается, что читатель уже знаком с этими методами и аппаратурой.
Вместе с тем между электрофорезом и ИЭФ существуют важные различия, поскольку фракционирование белков при ИЭФ идет по совсем иному принципу. В процессе электрофореза белки разделяются вследствие различия скоростей их миграции в электрическом поле, которые обусловлены суммарными электрическими зарядами белков в среде с неизменным pH и их размерами, определяющими степень торможения белков о сетку геля. При ИЭФ параметром фракционирования служит значение изоэлектрической точки (pi) белка как цвиттериона.
В первой главе подробно описан принцип метода ИЭФ, т. е. характер миграции белков под действием электрического поля в среде с изменяющейся вдоль пути этой миграции величиной pH («градиент pH»), Достаточно детально рассмотрен и способ образования градиента pH, в частности свойства «амфоли-тов» — веществ, формирующих этот градиент под действием электрического поля. Такое рассмотрение необходимо для понимания описанных ниже экспериментальных подходов и позволяет сразу же выявить некоторые уязвимые места метода, игнорирование которых может привести к артефактам. Вторая глава посвящена разбору аналитических вариантов ИЭФ, сгруппированных по типу используемых гелей: горизонтальные пластины полиакриламидного геля (ПААГ), вертикально стоящие трубки ПААГ и горизонтальные пластины агарозы. В отдельную главу выделен чрезвычайно плодотворный аналитический
ч»арреллим. 1ам же рассмотрены оолее поздние модифик. дии этого метода. Четвертая глава посвящена основным при мам препаративного ИЭФ белков. Наконец, в качестве допо. нения в главе пятой приведено краткое описание принципа возможностей метода изотахофореза. Для фракционирован и биополимеров он почти не применяется, поэтому мы ограничт ся лишь беглым знакомством с ним.
Глава 1 СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Вначале рассмотрим общие характерные особенности мек да, чтобы затем обратиться к его техническим деталям и вар! антам.
Смесь белков вносят в трубку или в объем пластины, запод ненные электропроводящей жидкостью. Возможность конве! ции устраняют либо полимеризацией в этой жидкости сети ПААГ или агарозы, либо помещением в нее гранулированног сефадекса, либо, наконец, образованием в жидкости градиент плотности раствора сахарозы. Вдоль трубки или одного из л! нейных размеров пластины в электропроводящей жидкости сс здают и поддерживают линейный градиент pH в определенно* наперед выбранном интервале значений. Жидкость обладае буферными свойствами, так что установившиеся значения pi вдоль градиента не изменяются в присутствии фракционируе мых белков.
Ниже подробно описано, каким образом выполняются вс эти условия и что это за жидкость, но сначала проанализируе: поведение растворенных в ней белков после того, как к конца: трубки или противоположным торцам пластины присоединил источник напряжения.
Протекание тока через жидкость сопровождается установле нием электрического поля, воздействующего на оказавшиеся нем белковые молекулы. Это воздействие приводит к их мигрс ции вдоль поля по направлению к аноду или катоду в завис* мости от знака суммарного электрического заряда каждой мс лекулы, подобно тому как это происходит при электрофорез* Скорость миграции пропорциональна напряженности электр* ческого поля и электрофоретической подвижности белка. Пс следняя, как известно, зависит от отношения суммарного зар? да к линейному размеру белковой молекулы.
Однако на этом сходство с электрофорезом кончается. От метим, прежде всего, что трение молекул белков о сетку гелз сефадекс или вязкий раствор сахарозы никакой роли в их фра* ционировании не играет. С ним приходится мириться в силу ш
' ' --- ----------- f ^ nun-
векции в жидкости, но не более того. Поэтому для ИЭФ используют крупнопористый ПААГ, агарозу и сефадекс. Последний, в отличие от ПААГ, должен быть достаточно мелкопористым, для того чтобы молекулы белка не проникали внутрь его гранул, а мигрировали в жидкости между ними. Размер белковых молекул, как уже упоминалось, вообще не имеет значения для их фракционирования; важно только значение pi. Рассмотрим качественно процесс фракционирования смеси белков в стационарном линейном градиенте pH электропроводящей жидкости, полагая, что характерные для всех белков значения pi лежат внутри этого градиента.
< 1 > 2 3 4 5 6 7 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed