Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Например, от 10 до 100 мкг суммарной РНК печени крысы растворяли в 25 мкл 0,05 М Na-фосфатного буфера (pH 7,4). В равном объеме того же буфера вносили 1,5 мКи Na125I (УАжЮ Ки/мг) и 0,1 мг Хлорамина Т и встряхивали 20 с при комнатной температуре. Для остановки реакции и предупреждения сорбции 1251 добавляли, как и для белков, 0,1 мл 5 мМ раствора тиосульфата натрия и 0,2 мл 0,1 М KI. Препарат очищали от невключившейся радиоактивности гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Уровень включения составил примерно 7X1010 расп./мин на 1 мг РНК [Shaposhnikov et а!., 1976].
Часто в качестве катализатора реакции используют треххлористый таллий (TlCIj). Его растворяют непосредственно
перед использованием. Реакцию ведут при pH 5. При рН^б включение резко падает — до 8% от исходного при pH 5. Метка из Na 1251 гораздо труднее включается в двунитевые структуры нуклеиновых кислот, чем в однонитевые [Scherberg, Refetoff, 1974].
В качестве недавнего примера приведем методику введения метки по mI в однонитевую ДНК [Leibovitch et al., 1979].
8—15 мкг одионитевой ДНК и 0,5 мКи Na,55I (без носителя) растворяли в 80 мкл 0,1 М CHaCOONa с 0,04 М СН3СООН, 17,5 мкМ КС1 и 0,15 мМ Т1СЦ. Реакцию вели при 60° в течение 15 мин. Затем для связывания непрореагировавшего иода в инкубационную смесь добавляли 5 мкл 0,01 М раствора тирозина к 10 мкл 2,8 М Na-фосфзтного буфера (pH 6,8). Для разрушения нестойких промежуточных соединений смесь держали еще 15 мин при 60°, затем охлаждали и очищали на колонке сефадекса G-50 (40X1,6 см). ДНК из раствора в 0,5 М NaCl переосаждали этанолом. Уровень включения составил 5Х109 имп./ мин на 1 мг ДНК. Аналогично проводили включение 1Я1 в РНК хлоропласте» [Hartley, 1979].
В качестве катализатора иногда используют треххлористый торий [Segni et al., 1979].
В заключение следует отметить, что все способы введения метки в нуклеиновые кислоты, кроме медленного водородного обмена, связаны с определенными химическими модификациями этих биополимеров. Учитывая строго детерминированную химическим составом матричную функцию большинства НК, такие модификации должны, как правило, приводить к нарушениям этой функции (в отличие от белков, где даже у ферментов есть «балластные» участки полипептидной цепи). В связи с этим для введения метки в НК in vitro в последние годы повсеместное распространение приобрели ферментативные методы, позволяющие включать 32Р из нуклеозидтрифосфатов и нуклеозиддифос-фатов с очень высокой УА.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ РЕАКЦИИ
В составе остатка фосфорной кислоты фосфор входит в каждое нуклеотидное звено ДНК и РНК. Его замещение на радиоактивный изотоп 32Р позволяет ввести очень высокую радиоактивность в каждую молекулу НК. Часто нет необходимости замещать все атомы фосфора, даже наоборот — бывает важно знать локализацию метки (секвенирование НК). В этих случаях ограничиваются замещением или присоединением одного атома 32Р на один из концов полинуклеотида. Разные ферментативные реакции используются для введения метки на 5'- или 3'-конец молекулы полимера. С этих реакций мы и начнем рассмотрение, а затем познакомимся с ферментной системой, позволяющей заменить все или почти все атомы фосфора в полимере на их радиоактивные изотопы.
Jt\dK ООЫЧНО, ДЛЯ фёрМЦНТН'ШЬП.ЬЛ.Л реалдип пидии^ Uiiimvici^io-
ных условий, вообще говоря, должен производиться для каждого нового типа нуклеиновой кислоты и новой партии фермента или радиоактивных предшественников. Тем не менее, можно в целях ориентировки привести для всех рассмотренных ниже реакций более или менее типичные их условия. Кроме того, целесообразно включить в прописи реакций краткие сведения о самих ферментах и условиях их хранения. Для простоты рубрикации в заголовки соответствующих разделов будут вынесены только названия ферментов.
Т4полинуклеотидкиназа
Фермент выделяют из клеток Е. соН, зараженных фагом Т4. С его помощью можно осуществить включение згР на б'-ОН-ко-нец ДНК или РНК из [7-32Р]-АТФ. Поскольку описываемый метод часто используется для введения метки в продукты гидролиза НК, уже имеющие на 5'-концах фосфаты, уместно начать с необходимой в этом случае подготовительной реакции удаления концевых фосфатов. Для этого обычно используют щелочную фосфатазу из ?. coli. Краткие сведения о ферменте: М» «*80 000 (димер); имеется два изофермента; нуждается в Zn2+ и Mga+; pi=4,5; рН0Пт=8; удельная активность 30—40 ед./мг; 1 ед. обеспечивает гидролиз 1 мкмоль я-нитрофенилфосфата с образованием окрашенного п-нитрофенола за 1 мин при 25° и pH 8. Хранят фермент в 0,01 М Трис-НС1 (pH 8) с 0,12 М NaCl и 50% глицерина при —20°.
3 мкг фрагментов ДНК и 0,24 ед. щелочной фосфатазы инкубируют в 10—20 мкл 0,1 М Трис-НС.1 (pH 8) с 0,1% ДДС--Na при 37° в течение часа (необходимое количество Zn2+ и Mg2+ содержится в самом препарате фермента). Реакцию останавливают разбавлением до 0,2 мл 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,4) с 0,1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА, а фермент удаляют путем фенольной депротеинизации (встряхивают с 0,2 мл фенола, насыщенного тем же буфером, и фенольный слой дополнительно экстрагируют 0,1 мл буфера). Водную фазу четырежды промывают эфиром. Дефосфорилированные фрагменты ДНК осаждают этанолом (3 ч при —70° и центрифугирование при 10 000 об./мин, 20 мин). Осадок перерастворяют в 0,2 М CH4CC0Na и снова осаждают тремя объемами этанола, сушат и растворяют в 20 мкл Н20 [Shinagawa, Padmanabhan, 1979]. Фенольной экстракции можно избежать, если есть возможность воспользоваться щелочной фосфатазой, иммобилизованной на сефарозе фирмы «BRL».
