Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для очистки от невключенной радиоактивности из-за малого количества меченого белка использовали его соосаждение с 50 мкг БСА в 15%-ном растворе ТХУ. Осадок промывали 4 раза по 3 мл при 0° смесью эфир—ацетон (3:1). Было получено включение порядка 3,5X10® имп./мин на 1 мг белка, т. е. выше, чем при иодировании Хлорамином Т или лактопероксидазой.
Любопытно сравнить эффективность включения изотопа в этом и предыдущем случаях и тем самым оценить значение указанной вариации соотношения реагентов. С учетом разбавления БСА при соосаждении УА модифицированного белка должна составлять примерно 3,5Х 109 имп./мин на 1 мг, т. е. в 700 раз выше, чем в предыдущем примере. Если принять во внимание, что эффективность счета трития примерно вдвое меньше, чем углерода, то соотношение истинных включенных радио-активностей составит примерно 1400: 1. Это как раз отвечает различию удельных (молярных) радиоактивностей исходных препаратов (1300:1). Таким образом, эффективность реакции метилирования изменилась мало — видимо, она не слишком «капризна» в отношении пропорций реагентов, если избыток участвующих в метилировании компонентов обеспечен.
Очистке белка от радиоактивного предшественника путем осаждения ТХУ было отдано предпочтение и в недавней работе Куна и Вилта. Хотя авторы работали с вдесятеро большим количеством белков хроматина (и осаждали их без носителя), но, по их данным, эти белки особенно склонны сорбироваться на сефадексе [Kuhn, Wilt, 1980].
Описанным методом удобно вводить метку в пептиды белкового гидролизата для их последующего картирования, например в двумерной системе ТСХ-электрофорез на пластинах, покрытых целлюлозой. Преимущество по сравнению с введением
t25I состоит в том, что заведомо метится каждый пептид, хотя бы по концевой аминогруппе. 20 мкг гидролизата белка растворяют в 10 мкл воды, добавляют 5 мкл 10 мМ раствора NaBH4 (меченного по 9Н, если необходимо) в 1 мМ NaOH, потом 5 раз с интервалом 5 мин вносят по 2 мкл 10 мМ раствора НСНО (меченного по 14С, если необходимо) в 12%-ном водном метаноле. Это обеспечивает пятикратный избыток НСНО по отношению к числу свободных аминогрупп и двукратный избыток NaBH4 по отношению к НСНО. Затем добавляют 10 мкл «холодного» 0,1 М NaBH4 для превращения избытка формальдегида в метанол, который испаряется при нанесении на ТСХ. Наконец, вносят 10 мкл 0,5 М НС1 для разрушения избытка NaBH4 и через 30 мин аликвоты по 2—10 мкг меченных пептидов наносят на пластинку для ТСХ [Nelles, Bamburg, 1979]. Заметим, что здесь NaBH4 вносят раньше НСОН, для того чтобы предупредить возможность алкилирования других боковых групп пептидов.
Следует добавить, что описанная реакция введения метки путем метилирования успешно идет в присутствии 1% ДДС-Na и что в нуклеиновые кислоты метка не включается.
Описано включение метки в белки из [3H]-NaBH4 в безводном диметилформамиде (ДМФА). Хотя результатом реакции и здесь является метилирование остатков лизина, но формальдегид в ней не участвует. По-видимому, промежуточным продуктом реакции служит восстановленный ДМФА, который затем, отщепляя диметиламин, присоединяется по ,e-NH2-rpynne лизина. Время полураспада боргидрида в ДМФА при нейтральном pH — около 1 ч. Метод удобен для введения метки в водонерастворимые белки соединительных тканей, например в срез кости, когда необходимо обеспечить проникновение боргидрида внутрь структуры за счет диффузии [Cheung et al., 1981].
Для введения стабильной метки 3Н в поверхностные белки интактной клеточной мембраны используют меченный тритием триметиламин-р-аланиновый эфир N-оксисукцинимида. Этот реагент, подобно иодсульфаниловой кислоте (см. выше), не проникает внутрь клетки. Отщепляя активирующий сукцинимид, он присоединяет [3Н]-тримегиламин-|5-аланин пептидной связью к аминогруппам поверхностных белков мембраны [Zisapel, Lit-tauer, 1978].
Недавно были описаны такие условия введения метки из [3H]-'NaBH4 в белки выделенных мембран эритроцитов, при которых они сохраняют способность осуществлять активный перенос через мембрану Са1+ и глицина и, вместе с тем, оказываются достаточно хорошо меченными для проведения их анализа двумерным электрофорезом по методу О’Фаррелла [Jones, Vida-ver, 1981 ].
Итак, из всех рассмотренных химических методов введения радиоактивной метки в белки удобнее всего, эффективнее и безопаснее с точки зрения сохранения активности белка исполь-
зовать реактив Болтона—Хантера для введения mI. Если же нужна долговременная метка 14С или 3Н, то следует воспользоваться метилированием белка по концевым аминогруппам и остаткам лизина с помощью формальдегида и боргидрнда.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
Введение радиоактивной метки в белок ферментативным путем удается осуществить в тех случаях, когда он способен фос-форилироваться с помощью соответствующей (чаще всего цАМФ-зависимой) протеинкиназы. Донором радиоактивного фосфора служит [733Р]-АТФ, который поставляется с УА до 5000 Ки/ммоль. Метод используется не для получения меченого белка, а для исследования самого фосфорилирования. Например, с его помощью недавно было показано, что на один моль суммарного препарата гистонов включается 0,33 моль заР, в то время как для гистона Н1 включение достигает уровня 0,85 моль [Knight, Skala, 1979].
