Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
разброс чувствительности благодаря постоянной толщине слоя эмульсии над
срезом [19].
Длительность экспозиции зависит от использованной метки. Сигнал,
источником которого служит тритий, должен быть виден через '5 дней. 35S
дает более быстрые результаты - сигнал появляется через 3 дня или даже
через 2, если относительное содержание молекул-мишеней особенно велико. В
начале экспериментов по гибридизации рекомендуется при каждом
Таблица 10.4. Гибридизация зонда на срезах
1. Приготовьте гибридизационный буфер. Его конечная концентрация: 50%
формамид, 0,3 М NaCI, 10 мМ трис-НС1 pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, раствор Денхардта
(0,02% БСА, 0,02% фиколл, 0,02% ПВП), 500 мкг/мл тРНК дрожжей. Для
повышения эффективности концентрации зонда можно включить 10%-ный
декстрансульфат, однако по некоторым данным разные партии этого препарата
вызывают значительные колебания в фоне на автографах.
2. Приготовьте аликвоты буфера в пробирках Eppendorf, достаточные для
того, чтобы покрыть одно стекло. 30 мкл гибрндизационной смеси покроют
площадь в 700-1000 мм2. Добавьте зонд в нужной концентрации.
3. На подготовленные препараты (табл. 10.3), которые должны быть
абсолютно сухими, нанесите 30-40 мкл смеси, поместив каплю над центром
среза.
4. Сверху опустите покровное стекло минимального размера, достаточного
для того, чтобы прикрыть срез. Опуская, сначала поставьте край стекла за
каплей, затем осторожно, при помощи часового пинцета, положите его па
каплю так, чтобы пузырьки воздуха вытеснялись за пределы покровного
стекла.
5. Немедленно окружите края стекла полоской минерального масла, или
резинового цемента, чтобы предотвратить испарение (Sigma поставляет
минеральное масло в удобных пластиковых пузырьках на 6 мл).
G. Пометьте стекла алмазным карандашом.
7. Гибридизуйте во влажной камере при температуре от 40 до 50 "С1* всю
ночь. Влажную камеру легко сделать из пластиковой коробки для
бутербродов, поместив на ее дно бумажную салфетку, пропитанную водой.
Салфетка должна быть влажной, но не должна смачивать нижние края стекол.
Крышка коробки заклеивается изоляционной лентой.
') В исследованиях по тепловой денатурации Коксом [9] приведен расчет,
свидетельствующий о том, что Тт для дуплексов РНК-РНК in situ примерно на
5 °С ниже, чем Тт в растворе для зондов длиной 100-200 оснований.
Максимум скорости гибридизации in situ приходится на 25 °С ниже
нормальной Тт. Снижение Тт для дуплексов РНК-РНК составляет 0.235 °С/%
формамида. в то время как для дуплексов ДНК- ДНК, -0,65 °С. Кроме того,
гибриды РНК-РНК примерно на 10 °С менее стабильны в отсутствие формамида,
чем дуплексы ДНК-ДНК. Обобщая эти данные, можно заключить. что
оптимальные температуры для гибридизации РНК-РНК находятся между 40 и 50
°С при гибридизации в 50%-ном формамнде.
2) В большинстве случаев реакция гибридизации заканчивается примерно
через 5 ч. Как правило, реакцию проводят всю ночь, поскольку это
допустимо и удобно для исследователя.
Таблица 10.5. Процедура отмывки
1. По окончании гибридизации извлеките препараты из влажной камеры.
Удалите минеральное масло отмывкой стекол в двух порциях хлороформа по 10
мин в каждой. Поверхностное натяжение препятствует отделению покровных
стекол, даже если их держать вертикально. Если был использован резиновый
цемент, снимите его.
2. Погрузите стекла в 4XSSC. Спустя минуту покровное стекло можно
осторожно снять, приподняв тонким пинцетом.
3. Промойте стекла в трех порциях 4XSSC, по 5 мин в каждой.
4. Удалите несвязавшийся зонд посредством инкубирования в 20 мкг/мл
РНКазы А в течение 30 мин прн 37 °С, как указано в п. 10 табл. 10,3.
5. Проинкубируйте в буфере РНКазы в течение 30 мии при 37 °С.
6. Проинкубируйте в 2XSSC в течение 30 мин при 45 °С.
7. Проинкубируйте в 0.1XSSC в течение 45 мии при 45°СП.
269
272
Глава 10
Рис. 10.2. Гибридизация зонда Тср-1 с областью спиниого мозга 11-
дневного" эмбриона мыши; в качестве отрицательного контроля использована
обратная' ннть Тср-1. А. Область спинного мозга, гибпидизованная с Тср-1,
в светлом
Гибридизация in situ с мРНК на гистологических срезах
273
поле микроскопа. Б. То же в темном поле. Обратите внимание на отсутствие
четкого паттерна гибридизации в светлом поле. В. Фоновая гибридизация с
обратной нитью Тср-1. Г. То же в темном поле. Увеличение Х500.
18-171
276
Глава 10
Рис. 10.4. Артефакт при окрашивании парафиновых срезов семенника.
Формирующиеся головки сперматид создают впечатление положительного
сигнала.
Увеличение Х4000.
связывания зонда. Некоторые клетки демонстрируют высокий уровень
неспецифического связывания, например, зрелые спер-матиды в семеннике
[22] (показаны на рис. 10.3). Окрашивание может быть источником
артефакта, когда специализированные клетки реагируют с красителем таким
образом, что появляются структуры, подобные гранулам серебра (рис. 10.4).
Однако применение указанных выше контролей устранит возможность неверных
выводов.
Благодарности
Авторы благодарны Мартину Берджину за изготовление гистологических
