Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
гибридизации) не такие жесткие.
5.2.2. Олигонуклеотидные зонды
Эти зонды используются для выделения индивидуальных членов мультигенных
семейств или в тех случаях, когда известна (частично или полностью)
только первичная структура белка. Обычно достаточно олигомера размером 20
оснований, гомологичного интересующей последовательности. Он может быть,
помечен либо с Б'-конца с помощью полинуклеотидкиназы (табл. 9.3,Б), либо
методом "заполнения" с использованием олигомера длиной в 8 оснований в
качестве затравки для синтеза комплементарной цепи (табл. 9.3,В).
5.2.3. Одноцепочечные кДНК-зонды
В тех случаях, когда возникает необходимость выделить последовательности,
уровень экспрессии которых на определенной стадии развития выше, чем на
других, следует воспользо-
254
Глава 9
Рис. 9.4. Фильтры из библиотеки кДНК клеток эмбриональной карциномы (ЭК),
несущие ~400 бляшек. Гибридизоваиы с одиоцепочечньши зондами кДНК (табл.
9.3,5), транскрибированными с РНК недифференцированных (-РК) илн
дифференцированных ( + РК) клеток ЭК. Стрелками отмечены бляшки, наиболее
активно гибридизовавшиеся с зондом недифференцированных клеток. РК -
ретиноевая кислота.
иаться техникой дифференциального скрининга. Для этою потребуются зонды
кДНК с высокой удельной активностью (приготовленные из двух популяций
РНК, которые сравнивают) и фаг, высеянный при низкой плотности (~400
бляшек иа чашку 90 мм). Одноцепочечные зонды кДНК синтезируются в
соответствии с прописью табл. 9.3, Г, удельная активность должна
превышать 108 имп/мин/мкг. Типичный паттерн гибридизации представлен на
рис. 9.4. Эта пара фильтров с отпечатками из библиотеки кДНК клеток
эмбриональной карциномы (ЭК) была гибридизована с зондами, полученными
для РНК дифференцированных (дифференцировку индуцировали ретиное-вой
кислотой) и недифференцированных клеток ЭК- Между двумя фильтрами четко
видны различия; некоторые клоны экспрессированы на более высоком уровне в
недифференцированных клетках, для экспрессии других характерна обратная
закономерность. Описанный нами подход можно применить к скринингу
библиотек эмбриона, когда имеется достаточное количество материала.
Заметим, что зонды, полученные прн использовании случайной затравки,
имеют в этом случае преимущество перед кДНК с oligo (dt) -затравками. Во-
первых, с их помощью может быть получена более высокая удельная
активность (~в 10 раз), и во-вторых, могут быть обнаружены все
Библиотека кДНК для предимплаитациоииого эмбриона мыши 2Г>5.
гомологичные клоны (из-за отсутствия предпочтения З'-конце-вых
последовательностей, как в случае зондов с oligo(dt)-затравкой).
5.2.4. Гибридный блок
При необходимости выделить клон, кодирующий белок, который был
идентифицирован путем трансляции in vitro, используется процедура
гибридного блока трансляции [33]. Ее успех зависит от способности мРНК к
отжигу с клоном комплементарной ей кДНК- Предложенные в последнее время
усовершенствования методики гибридного блока (см. детали н работе [34])
делают ее более приемлемой для анализа систем с ограниченным материалом,
чем методы гибридной селекции и трансляции мРНК.
5.2.S. Гибридизация in situ
Существует возможность идентифицировать ткане- или клетка-специфическую
экспрессию мРНК, кодируемой индивидуальным клоном кДНК, посредством
гибридизации in situ (см. гл. 10). Эта техника вполне пригодна и для
изучения паттерна экспрессии интересующей нас клонированной
последовательности. Она с успехом применялась в отношении ранних стадий
развития мыши [35]. Наиболее очевидное преимущество этого метода перед
процедурами скрининга заключается в том, что он подразумевает
использование небольшого числа эмбрионов. Гибридизация in situ служит
незаменимым инструментом при изучении экспрессии генов у эмбрионов
Drosophila. Можно надеяться, что дальнейшее усовершенствование техники
эксперимента даст возможность использовать гибридизацию in situ па срезах
мышиного эмбриона в качестве процедуры скрининга клонов кДНК-
Благодарности
Мы выражаем благодарность Джиму Джексону за сотрудничество и большой
вклад в разработку методики клонирования кДНК- Мы благодарны Дж. Дэвису и
Д. Ломоносову за предоставленную для работы РНК CPMV. Большое спасибо
нашим коллегам в Кэмбридже за их помощь в сборе ооцитов и бла-етоцист
мыши. Мы благодарим Мартина Джонсона, Питера Ригби и Кейт Уиллисон за
плодотворные обсуждения.
256
Глава 9
Литература
1. Johnson М. Н., McConnell J., Van Blerkom J. (1984). J. Embryol. Exp.
Morphol., 83 (suppl.), 197.
2. Hewlett S. K-, Bolton V. N. (1985). J. Embryol. Exp. Morphol., 87,
175.
3. Piko L" Clegg К. B. (1982). Dev. Biol., 89, 362.
4. Johnson М. H. (1981). Biol. Rev., 56, 463.
5. Flach G., Johnson М. H., Braude P. P., Taylor R. A. S., Bolton V. N.
(1982). EMBO J., 1, 681.
6. Clegg К. B., Piko L. (1983). J. Embryol. Exp. Morphol., 74, 169.
7. Bolton V. N., Oades P. J., Johnson М. H. (1984). J. Embryol. Exp.
Morphol., 79 139
