Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Модифицированный метод Троувелла в настоящее время широко используется для эмбриональных и взрослых тканей. Ниже приведено его описание (рис. 7.6 и 7.7).
Сетка
7.1. Материалы
Стерильная дистиллированная вода или раствор Хэнкса.
Чашки Петри диаметром 91 мм.
Кружки фильтровальной бумаги, соответствующие размерам дна чашек Петри с двумя круглыми отверстиями диаметром
3,5 см.
Пластиковые культуральные камеры диаметром 32 мм (Sterilin) Бумага для чистки оптики (Gurr, London), обезжиренная эфи-
Рис. 7.7. Модифицированный метод Троувелла. Чашка Петрн с камерами для клеток, сетки н полоски миллипоровых фильтров.
ром и спиртом (метод подготовки бумаги приведен в разд. 7.1.1). Миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,5 мкм (Millipore Corp., Benford, МА, USA), нарезанные перед стерилизацией на полоски размером 1X2,2.
Вместо миллипоровых фильтров можно использовать поли-карбонатные мембраны (Nucleopore Sterilin). Они прозрачны, не содержат детергентов, поэтому эксплантаты, растущие на таких мембранах, можно осматривать в ходе культивирования. Таким способом можно культивировать целые органы, например эмбриональные молочные железы. Ткань можно фиксировать и исследовать непосредственно на мембранах, что позволит избежать приготовления срезов.
Сетки из листового металла (Expanded Metal. Co., Harlepool, UK), (площадь поверхности 18 мм2, высота 4 мм) вырезаются ножницами из листов большего размера. Края сеток загибают-
ся вниз, образуя скамейку или столик. После использования погрузите металлическую сетку в концентрированную азотную кислоту и оставьте там на 24—48 ч. Затем промойте сетку проточной водопроводной водой в течение 24 ч. Трижды ополосните дистиллированной водой и высушите в сушильном шкафу. Азотная кислота может быть использована несколько раз.
Среда 199 на солевом растворе Эрла.
Среда 199 на солевом растворе Хэнкса (поддерживающая среда).
Инсулин (Sigma).
Сыворотка новорожденных телят, инактивированная нагреванием.
Универсальные контейнеры (стеклянные или пластиковые) емкостью 20 мл.
Бутыли Биджу стеклянные, емкостью 5 мл.
Градуированные пипетки.
Подставки для пипеток.
Пастеровские пипетки.
Пенициллин (Glaxo).
Стрептомицин (Glaxo).
Фунгизон (Flow Laboratories, Irvine, UK)-2 пары прямых пинцетов длиной около 10 см.
2 пары прямых ножниц длиной около 10 см.
2 пары прямых тонких ножниц.
2 пары часовых пинцетов № 3 или 4 (Weiss, London, UK)-2 катарактных ножа.
2 ножа Сванн-Мортона № 10, перед использованием обезжирить абсолютным этанолом.
Предметные стекла с лункой.
Стеклянная пластинка площадью 8 см2 для препарирования. 70%-ный этанол.
Лоток из нержавеющей стали.
Анаэробный сосуд Макинтоша и Филдса (модифицированный). Газовый баллон, содержащий смесь 5% С02 и 95% кислорода.
7.1.1. Подготовка бумаги для чистки оптики к культивированию
Такая бумага обычно покрыта слоем жира, который должен быть удален перед использованием.
I. Разрежьте бумагу на кусочки размером примерно 5X8 см и поместите их в чашку Петри.
II. Залейте эфиром на 1 ч, затем смените эфир и оставьте еще на 1 ч.
III. Удалите эфир и залейте на 1 ч абсолютным этанолом. Смените абсолютный этанол и оставьте еще на 1 ч. Удалите абсолютный этанол и 8—10 раз промойте перегнанной в стекле дистиллированной водой. Оставьте бумагу в ди-
стиллированной воде на ночь. Высушите в сушильном шка-ФУ (37 °С).
IV. Перед использованием нарежьте полоски нужного размера и простерилизуйте сухим жаром или в автоклаве.
7.2. Получение эксплантатов
I. Прежде чем начинать препарировать орган, соберите аппаратуру, необходимую для культивирования, и приготовьте среду.
II. Три слоя фильтровальной бумаги, вставленной перед стерилизацией в чашки Петри, смочите 10 мл дистиллированной воды или раствора Хэнкса.
III. Поместите две пластиковые культуральные камеры в прорезанные в бумаге отверстия в каждой чашке и установите в камеры металлические сетки.
IV. Заполните дополнительную чашку Петри средой 199 (на со-
левом растворе Хэнкса), содержащей 2% телячьей сыворотки для промывки и увлажнения ткани перед и в течение препарирования.
Процедура препарирования существенно меняется при работе
с разными тканями. Ниже подробно рассмотрено препарирование предстательной железы, трахеи и кожи.
7.2.1. Предствтельнвя железа
Получение ткани от мышей и крыс в возрасте от 6 нед до
6 мес.
I. Зафиксируйте животное булавками на корковой подложке и тщательно промойте шкурку 70%-ным этанолом.
II. Вскройте кожу на брюшке парой прямых ножниц, делая один горизонтальный и два вертикальных разреза. Зафиксируйте оттянутую полоску кожи булавками, обнажив область около мочевого пузыря.
III. Поднимите мочевой пузырь часовым пинцетом и перережьте его связку с подлежащими мышцами. Обнажите лежащую ниже предстательную железу. Вы узнаете ее по блестящей, «перламутровой» поверхности.
IV. Оттяните предстательную железу часовым пинцетом и от-
режьте от основания пузыря тонкими ножницами.
