Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
II. Продуйте камеру газовой смесью (5% С02, 45% 02, 50% Na).
III. Поместите камеру на качающуюся платформу и установите скорость качаний в пределах от 3 до 10 в мин в зависимости от типа культивируемой ткани. В результате будет
происходить чередующееся омывание поверхности эксплантатов.
Собранный блок помещается в большинство стандартных термостатов.
8.4. Смена среды
Среду меняют два или три раза в неделю и после каждой смены среды камеру продувают газовой смесью, устанавливают на качающуюся платформу и вновь помещают в термостат.
Использование этой техники обеспечивает поддержание ткани в культуре в течение длительного периода при минимальных изменениях характера роста (табл. 7.1).
9. Подготовка органных культур для световой микроскопии
Приготовление гистологических срезов органных культур производится в основном стандартным способом; иногда снижается время обработки различными препаратами.
9.1. Материалы
Фиксатор Буэна или 3%-ный уксусный фиксатор Ценкера. Набор растворов этанола (50% —100%).
1%-ный эозин в 70%-ном этаноле.
Кедровое масло.
Мягкий парафин, плавящийся при 45—56 °С (Raymond Lamb, Sunbeam Road, London).
Твердый парафин с точкой плавления 63 °С (Raymond Lamb, Sunbeam Road, London).
2 иглы.
2 катарактных ножа.
Стеклянные часовые стекла диаметром 5 см.
Пипетки с широким кончиком.
Нагревательный столик с пластинкой.
9.2. Фиксация и обезвоживание препаратов
I. В конце периода культивирования выньте полоски с эксплантатами из среды и ополосните холодным раствором Хэнкса.
II. Высушите на фильтровальной бумаге.
III. Погрузите полоски с эксплантатами в фиксатор на 35— 40 мин.
IV. Если применялся фиксатор Буэна, проведите полоски через несколько смен 70%-ного этанола.
V. После фиксатора Ценкера промойте препараты проточной водой в течение 1 ч, затем 1 ч—50%-ным этанолом, 1 ч — 70%-ным этанолом, оставьте на ночь в 70%-ном этаноле и затем 1—1,5 ч обработайте 90%-ным этанолом.
VI. Удалите эксплантаты с полосок, используя катарактные ножи.
VII. Добавьте несколько капель 1%-ного эозина к 95%-ному этанолу. Перенесите эксплантаты в 95%-ный этанол с эозином и оставьте на 30 мин.
VIII. Проведите через две смены абсолютного этанола по 1 ч в каждой. Перенесите препараты в кедровое масло на 1 ч, смените масло и оставьте на ночь. Утром проведите через мягкий парафин 1—1,5 ч и мягкий парафин 1,5—2 ч, а за-тем через 2 смены твердого парафина по 30 мин—1 ч в каждой.
9.2.1. Заключение препаратов
I. Нагрейте часовое стекло на нагревательном столике.
II. Заполните стекло твердым парафином (не до краев).
III. Перенесите на часовое стекло эксплантаты в парафине, используя пипетку с широким кончиком.
IV. Сориентируйте эксплантаты в парафине с помощью двух игл до отвердения парафина. После отвердения поместите стекло с препаратами в холодную водопроводную воду. Это облегчит отделение парафинового блока от часового стекла.
V. Установите блок в микротом и приготовьте серийные срезы толщиной 5—6 мкм.
VI. Срезы выдерживайте до окрашивания не менее 1 дня.
9.3. Методы окрашивания
Перед окрашиванием срезы должны быть депарафинизиро* ваны ксилолом и обработаны серией этанолов с понижающейся концентрацией, вплоть до дистиллированной воды. Примечание. Поскольку пары ксилола токсичны и могут быть канцерогенными, работать с ним следует в вытяжном шкафу.
I. Обработать каждый срез ксилолом в течение 5 мин.
II. Сменить ксилол на свежий.
III. На этом этапе убедитесь, что парафин полностью удален. Если нет, верните в ксилол до полного растворения парафина. Проводка: абсолютный этанол и 95%-ный этанол по 5 мин в каждом, 70%-ный этанол, 50%-ный этанол, дистиллированная вода.
9.3.1. Гематоксилин-эозин
Это стандартная окраска, благодаря которой получены основные результаты в области нормальной и патологической гистологии.
I. Схема окрашивания.
а) Гематоксилин Эрлиха, 5—15 мин.
б) Быстро промойте срезы дистиллированной водой.
в) Удалите избыток красителя путем дифференцирования в подкисленном спирте (1%-ная соляная кислота в 70%-ном этаноле) в течение нескольких секунд. Под действием кислоты голубая окраска гематоксилина меняется на красную.
г) Быстро промойте дистиллированной водой.
д) Восстановите голубую окраску, промойте срезы в подщелоченной проточной воде в течение 5—15 мин при комнатной температуре. Окрасьте 1%-ным водным эозином в течение 1—3 мин.
е) Удалите избыток краски дистиллированной водой, обезводьте спиртами и осветлите ксилолом, учитывая, что эозин отмывается дистиллированной водой и разбавленными спиртами, но плохо отмывается абсолютным этанолом. Степень окрашивания, таким образом, легко контролируется, и любое перекрашивание может быть устранено при проводке через разведенные спирты. Рекомендуется следующая продолжительность процедур: по 2—3 с — в 70%-ном и 90%-ном этаноле, 30 с — в абсолютном этаноле, 1—2 мин — в первой порции ксилола, 1—2 мин или более — во второй порции ксилола.
