Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
4. Техника одиночного предметного стекла (метод Максимова)
Это модификация метода часовых стекл, предложенного Феллом и Робисоном [6]. В основе его лежит также техника двойных покровных стекол, при которой клетки растут на сгустке экстракта и плазмы [34]. Этот метод был успешно приспособлен Харди [35] для онтогенетических исследований эмбриональных органов и их зачатков (рис. 7.4). Харди рекомендовал этот
Сгусток плазмы
Рнс. 7.4. Метод висячей капли (Максимова) по Харди, 1978 [35].
метод исследователям с ограниченными бюджетом и инструментальным обеспечением исследований, а также когда главной целью исследования является изучение изменения морфогенеза или мерцательной и секреторной активностей. Все эти изменения могут быть обнаружены с помощью обычного светового микроскопа или светового микроскопа с поляризационной или ультрафиолетовой оптикой.
4.1. Материалы
Помимо материалов, указанных в разд. 3, требуются следующие материалы.
Предметные стекла 75X45 мм с лункой глубиной 6—7 мм. Покровные стекла № 3 (40X48 мм).
Пинцет для покровных стекол.
Лезвия безопасной бритвы и скальпель.
Вазелин и парапласт (4 части парапласта смешиваются с 1 частью вазелина для приклеивания покровных стекол к камерам). Тонкая кисточка из натуральной щетины для нанесения смеси парапласта с вазелином.
4.2. Приготовление культуры
I. Используя тонкие ножи и анатомические иглы, разделите орган или зачаток на кусочки соответствующего размера (не превышающие 2x1, 5X1 мм) в растворе Хэнкса.
II. Используя пинцет для покровных стекол, поместите покровное стекло размером 40X48 мм в чашку Петри.
III. С помощью пастеровской пипетки нанесите три капли плазмы кур на центр стекла. Перемешайте плазму стеклянной палочкой так, чтобы она образовала круг диаметром 25 мм.
IV. Второй пипеткой добавьте одну каплю экстракта куриных эмбрионов (50%) к плазме и быстро и тщательно перемешайте стеклянной палочкой.
V. После образования сгустка поместите 1—3 эксплантата на сгусток. Лучше, чтобы стромальная поверхность эксплантата была обращена к сгустку.
VI. Перенос эксплантатов осуществляйте с помощью скальпеля или пипетки с широким носиком. В последнем случае засосите в пипетку эксплантаты с раствором Хэнкса и перенесите на сгусток. Избыток раствора Хэнкса удалите капиллярной пипеткой.
VII. Переверните покровное стекло со сгустком и эксплантата-
ми, используя пинцет для покровных стекол, и установите его над лункой предметного стекла Максимова. Заклейте камеру тремя слоями смеси парапласт/вазелин, прогретой до 60°С.
VIII. Инкубируйте камеры на предметном стекле при определенной температуре.
4.3. Смена среды
I. Приготовьте свежий сгусток по описанной ранее методике. Удалите парафиновое уплотнение с помощью прогретого скальпеля или безопасной бритвы.
II. Переверните покровное стекло на столик бинокулярной лупы. С помощью тонкого пинцета и анатомических игл отделите эксплантаты от сгустка и перенесите их в лунку предметного стекла для промывки раствором Хэнкса (две смены раствора по 5 мин).
III. Перенесите каждый эксплантат на свежий сгусток. Установите перевернутое покровное стекло над лункой стекла Максимова и заклейте камеру, как указывалось выше.
Как было показано Харди [35], этот метод применим для изучения роста волос и дифференцировки кожи мышиных эмбрионов f36], действия гормонов на влагалище новорожденных мышей [37], дифференцировки гонад у мышиных эмбрионов [38].
Метод менее пригоден для высокоподвижных тканей, таких как эмбриональный кишечник или органы с высокой секреторной активностью. Он позволяет проводить анализ живых экс-
плантатов с помощью световой микроскопии, но изображения получаются не очень контрастными, а достаточно большая толщина ткани не позволяет применять фазовый контраст.
5. Техника агарового геля
Этот метод, лишенный многих недостатков, типичных для плазменного сгустка, позволяет избежать разжижения сгустка и дает возможность использовать химически определенные среды. Впервые техника агарового сгустка была предложена Спраттом [10], который использовал 3%-ный агаровый гель на растворе Рингера, а впоследствии 4%-ный гель, содержащий забуференный бикарбонатом солевой раствор, глюкозу, 11 аминокислот, 10 витаминов и агар [11]. Вольф и Хаффен модифицировали метод Гейларда [9] для изучения развития и диффе-ренцировки органов или зачатков органов амфибий, птиц и млекопитающих. Они использовали агаровый гель в эмбриологическом часовом стекле. Первоначально предложенная ими среда состояла из 1%-ного агара, растворенного в растворе Гэя с 50%-ным экстрактом куриных эмбрионов и раствором Тиро-де. В более поздних модификациях в агар добавлялась куриная или лошадиная сыворотка либо эмбриональный экстракт заменялся на некоторые аминокислоты и витамины [39].
Вольфф [40] обнаружил что некоторые зачатки эмбриональных органов инкапсулируются клетками, мигрирующими с раневой поверхности эксплантатов. Для предотвращения этого процесса он заворачивал ткани в кусочки вителлиновой мембраны, выделенной из куриных яиц.
