Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
2.4. Чувствительность
Обнаружение множественных копий транскриптов гена в цитоплазме фиксированных клеток в отличие от выявления уникальных генов сравнительно слабо зависит от удельной актив-
ности зонда. Однако при выявлении транскриптов гена вступают в силу другие факторы. Так, чувствительность метода гибридизации при локализации специфических клеточных мРНК определяется главным образом степенью их удержания в ходе предшествующих гибридизации манипуляций и доступностью этих РНК для зондов.
2.4.1. Удержание клеточных РНК
Удержание РНК в фиксированных цитологических препаратах анализировали окрашиванием акридиновым оранжевым на каждом этапе предварительной обработки перед гибридизацией [8]. Полученные результаты показывают, что фиксация 2%-ным параформальдегидом обеспечивает более воспроизводимое удержание РНК, чем фиксация смесью этанол/уксусная кислота, предлагавшаяся в исходной методике. Прекрасное удержание РНК достигается при фиксации смесью метанол/ТХУ [9]. Глутаровый альдегид (0,2%-ный) в 0,1 М какоддлате натрия, используемый для фиксации криостатных срезов, также обеспечивает стабильное удержание РНК.
2.4.2. Доступность клеточных последовательностей РНК
Доступность клеточных РНК, являющихся мишенями, оптимальна после инкубации клеток или срезов тканей с проназой или протеиназой К. Сразу после протеолитической обработки клетки инкубируют с параформальдегндом для индукции поперечных сшивок экспонированной клеточной РНК с остающимися клеточными компонентами или желатином, покрывающим предметное стекло [10]. Протеолитическая обработка и фиксация параформальдегидом вдвое увеличивают чувствительность выявления мишеней, не влияя на морфологию клеток.
2.5. Усиление сигнала
10%-ный декстрансульфат увеличивает скорость гибридизации зондов ДНК с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами. Более того, если ДНК первоначально случайным образом фрагментирована и денатурирована, то декстрансульфат способствует образованию своеобразной сети зонда П1]. Так, например, если пометить ДНК ник-трансляцией [12], а затем денатурировать, то частично комплементарные участки ДНК гибридизируются, образуя обширные сети ДНК. Более того при подготовке проб ДНК путем репликации в плазмидах имеет смысл метить всю рекомбинантную молекулу, поскольку последовательности векторной ДНК могут участвовать в формировании сети. Было установлено, что добавление 10%-ного декстран-сульфата в используемый при гибридизации буфер приводит
к 4-кратному увеличению чувствительности в обнаружении сигнала.
Сетевые зонды могут быть также сконструированы из поли (А)+-содержащих зондов, которые после гибридизации выявляются с помощью ДНК, содержащих хвосты из 1251-поли(бром-дезоксиуридина) (например, высокомолекулярных ДНК морских ежей). В образовании сетей ДНК могут также участвовать рассеянные повторяющиеся последовательности [13].
2.6. Эффективность радиоавтографии
Эффективность радиоавтографии в выявлении меченных тритием молекул составляет около 5—10%. Нуклеотиды, меченные 1251 и 35S, обеспечивают более высокую эффективность выявления метки на автографах по сравнению с распадами 3Н при сохранении адекватного для многих целей разрешения в световом микроскопе (например, для обнаружения генов вирусов и цитоплазматических мРНК). Меченные 1251 комплементарные РНК вируса SV40 обеспечивают достаточное количество зерен серебра на автографах после недельной экспозиции, когда с помощью гибридизации выявляется один участок вирусной интеграции на диплоидный набор хромосом [14].
3. Подготовка реагентов и материалы
3.1. Материалы
Покровные стекла диа- Выдержите ночь в хромовой кислоте, промойте метром 16 мм 2 ч проточной водопроводной, а затем дистил-
лированной водой. Храните в 70%-ном этаноле Предметные стекла, по- Промойте стекла кислотой, как указано выше, крытые желатином После дистиллированной воды опустите стекла
в свежеприготовленные желатиновые хромовые квасцы при комнатной температуре. Дайте стечь избытку квасцов, высушите стекла в помещении без пыли и храните при 4 "С
3.2. Основные реагенты
Желатиновые хромовые Желатин 5 г
квасцы Хромовые квасцы 0,5 г
Дистиллированная вода 1 л
Фосфатный солевой буфер NaCl 8,0 г
(ФСБ) КС1 0,2 г
Na2HP04 1,14 г
КН2Р04 0,2 г
Дистиллированная вода 1 л
Довести pH до 7,3 Стандартный солевой цит- Хлорид натрия 175 г
ратный раствор (20-крат- Цитрат натрия 88 г
ный) Дистиллированная вода 1 л
