Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Более плодотворным оказался подход, основанный на том, что характерные изменения спектра поглощения с максимумом при 320 нм наблюдаются при связывании с
152
А Я320
Tuanurtrjupaipacipam / Транскетолаза
Рис. 10. Титрование апотранскетолазы тиаминпирофосфатом п присутствии кальция [279]
По оси ординат — изменение оптической плотности при 320 нм. По оси абсцисс — количество молей тиаминпирофосфата, добавленных в ироб>, на моль апофермента. Концентрация белка — 3.57-10-® М
анотранскетолазон только тех молекул тиаминпирофосфата, которые, связавшись с белком, обладают каталитической активностью (см. стр. 149). При этом исходили из того, что кофермент в присутствии кальция характеризуется достаточно высоким сродством к апоферменту (см. стр. 151). Па рис. 40 изображена кривая титрования апотранскетолазы тиаминпирофосфатом. При низкой концентрации кофермента наблюдается линейная зависимость между изменением оптической плотности ирн 320 нм и количеством добавленного тиаминпирофосфата. В этих условиях кофермент связывается с белком полностью, и при связывании одного моля тиамнипирофосфа-та на моль фермента изменение оптической плотности составляет 50% от максимального. Отсюда можно сделать вывод о наличии в транскетолазе двух активных центров, что хорошо согласуется с тем, что молекула фермента состоит нз двух идентичных субъединиц.
При достаточно высоких концентрациях тиаминпирофосфата, когда с молем белка связывается больше одного моля кофермента, линейность графика нарушается (см. рис. 40). Это находится в соответствии с различными величинами константы ассоциации для двух участков связывания они различаются примерно на порядок.
,153
Попытки реконструировать холотранскетолазу из апотранскетолазы, лишенной кальция и тиаминпирофосфата в среде, пе содержавшей двухвалентных катионов, успеха не имели [32]. Следовательно, для образования холофермента из апо- и кофермента наличие двухвалентных катионов является обязательным. Так как в нативном холоферменте обнаружен только кальций, то «истинным» кофактором транскетолазы следует считать именно этот металл, а не магний, как думали раньше.
Другие тиаминовые ферменты
В высокоочищенных препаратах пируватдекарбокси-лазы пивных дрожжей обнаружено три моля тиаминпирофосфата на моль белка. Такой фермент частично разобщен от кофермента и активируется примерно на 30% при добавлении тиаминпирофосфата и магния в насыщающих концентрациях [516]. На основании полученных экспериментальных данных авторы выдвигают предположение о том, что нативный холофермент имеет четыре активных центра, с одним из которых кофермент связан менее прочно и отщепляется в процессе выделения и очистки пируватдекарбоксилазы.
Предположение о наличии четырех активных центров в молекуле вышеуказанного фермента получило подтверждение в лаборатории Шелленбергера [507]. Авторы в своих опытах использовали в качестве субстрата меченную но углероду глиоксиловую кислоту. Специфика этого субстрата заключается в том, что его ферментативное превращение под действием пируватдекарбоксилазы останавливается па стадии отщепления С02. Образую щийся на данной стадии реакции промежуточный продукт (очевидно, оксиметил) остается прочно связанным с тиаминпирофосфатом, лишая тем самым кофермент его каталитических свойств. В этих условиях на каждый моль холопируватдекарбоксилазы выделялось четыре моля углекислого газа.
В пируватдекарбоксилазе пируватдегидрогеназного комплекса Е. coli на основании результатов измерения величины коэффициента Хилла предполагается наличие двух субстрат связывающих участков на молекулу фермента [457].
154
Пиру ватдекарбоксилаза пируватдегидрогеназного комплекса сердца свиньи связывает одну молекулу тиаминпирофосфата в присутствии кальция и две молекулы— в его отсутствие [294]. Никаких экспериментальных данных при этом не приводится, и поэтому неясно, обе ли молекулы кофермента во втором случае выполняют каталитическую функцию.
Таким образом, сведения о количестве активных центров в тиаминовых ферментах немногочисленны и в ряде случаев недостаточно полные. С уверенностью можно говорить лишь о транскетолазе, выделенной из пекарских дрожжей и листьев шпината, а также о пируватдекар-боксилазе пивных дрожжей. В первом случае фермент, состоящий из двух субъединиц, имеет два активных центра. Во втором случае в нативном холоферменте, состоящем из одной полипептидной цепи и максимально активном без добавления извне кофакторов, обнаружена одна молекула кофермента. В третьем — на две субъединицы приходится, очевидно, четыре каталитически активных молекулы тиаминпирофосфата.
Глава девятая
РЕГУЛЯЦИЯ
ПИРУВАТДЕКАРБОКСИЛАЗА
При достаточно высоких концентрациях пирувата, которые обычно использовали при исследовании пируватдекарбоксилазы пивных дрожжей, зависимость скорости реакции от концентрации субстрата выражалась гиперболической кривой [233, 240]. С низкими концентрациями пирувата кривая приобретала вид сигмоиды, что отчетливо видно из результатов, представленных на рис. 41. Изображение полученных данных в обратных величинах дает прямую линию лишь в области высоких концентраций субстрата. Полное спрямление кривой получается в том случае, когда по абсциссе вместо 1/[S1 откладывается I/[S]2, что указывает на наличие в молекуле фермента по крайней мере двух участков связывания для пирувата. Такой вывод подтверждается и при определении коэффициента Хилла, который оказался равным 1,7—1,8 (рис. 42, кривая /).
