Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Инкубационная смесь содержала 1 • 10~2 М магний.
В качестве субстрата фосфатазы добавлена фосфорилированная (32Р)-пируватдекарбоксилаза, изолированная из пируватдегидрогеназного комплекса
Инкубационная смесь Фосфатазная активность, нмоли **РН.
отщепившегося за 1 мии/мг фосфатазы
почки сердечная мышца
Фосфатаза 2,6 2,1
То же+Са2+ 2,7 3,2
» +ЭГТА 2,8 3,3
» +ЭГТА+Са2+ 3,3 4,3
Липоилтрансацетилаза 0,0 0,0
Фосфатаза-f-Л Т А 22,8 20,5
То же-fЛТА+Са2+ 34,2 17,5
» -f ЛТА-f Ca2+Mg2+ 0,0 0,0
> +ЛТА+ЭГТА 5,8 5,6
> +ЛТА+ЭГТА+Са2+ 32,1 27,7
плексона и се увеличение при добавлении кальция наблюдали и при работе с пнруватдегидрогеназными комплексами [259, 474].
Существенно отметить, что влияние ЭГТА (при работе с пнруватдекарбоксилазой) наблюдалось только в присутствии липоилтрансацетилазы. Без нее отщепление фосфора от фосфорилированной пируватдекарбоксилазы под действием фосфатазы происходило с одинаковой скоростью вне зависимости от того, имелся в системе ЭГТА или нет (табл. 18). В присутствии кальция, но без добавления магния дефосфорилирования не наблюдалось, т. е. кальций не мог замещать магний в качестве компонента фосфатазной реакции, а значит он не участвует непосредственно в дефосфорилировании. Не имеет он отношения и к связыванию пируватдекарбоксилазы с трансацетил азой, так как скорость реконструкции пируватдегидрогеназного комплекса из пируватдекарбоксилазы, липоилтрансацетилазы и линоилдегидрогеназы не снижалась в присутствии ЭГТА. Оставалось предположить,
170
что ион кальция участвует в связывании фосфатазы трансацетплазой. Для проверки такого предположения были поставлены следующие эксперименты [383].
Два указанных фермента преинкубировали с ЭГТА, кальцием, магнием и пируватдекарбоксилазой, взятыми в разных сочетаниях. Затем с помощью ультрацептрифу-гироваиия отделяли свободную фосфитазу от комплекса фосфатазы с трапсацетплазой. В осадке, содержащем комплекс двух ферментов, определяли величину фосфа-тазной активности. Из данных, представленных ниже, видно, что количество фосфатазы, связанной с липоил-трансацстнлазой, не изменяется при добавлении магния или пируватдекарбоксилазы, увеличивается в присутствии кальция и уменьшается в присутствии ЭГТА. Действие комплексона снималось кальцием.
Инкубационная смесь
Липоилтрансацетилаза (ЛТА)
Фосфатаза 4* ЛТА
То же -[* ЛТА Са2+
» 4* ЛТА + ЭГТА
» + ЛТА + ЭГТА 4- Са2+
» 4- ЛТА 4- ЭГТА 4- Mg2+
» 4* ЛТА 4- ЭГТА 4- Mg2+ 4- Са2+
» 4* ЛТА 4- ЭГТА 4* Mg2+ 4- Са2+
ватдекарбоксилаза
Дальнейшие исследования показали, что повышение фосфатазной активности под действием липоилтрансаце-тилазы при наличии в среде ионов кальция обусловлено повышением сродства фосфорнлировапиой ппр\ватдекар-боксилазы к фосфатазе. При наличии в срсде липоил-трансацетилазы, но без кальция, кажущаяся величина Km пируватдегидрогеназы-фосфатазы почек быка для субстрата (фосфори тированная пнруватдекарбоксилаза) равнялась 5,8 -10-5 М. В тех же условиях, но с кальцием, значение Km уменьшалось в 20 раз. Максимальная скорость реакции дефосфорилирования оставалась при этом неизменной. Таким образом, кальций, способствуя переходу свободной формы фосфатазы в связанную, тем самым повышает ее сродство к фосфорнлировапиой пиру-ватдекарбоксилазе [383].
.Активность связанной фосфатазы. нмоли *аРи, высвободившегося за 1 мин
0,0 0,039 0,171 0,018 0,165 0,010 0,174
4-гшру-
0,171
171
Как уже указывалось выше (см. табл. 18), активность фосфатазы пируватдегидрогеназы повышается примерно в 10 раз при связывании ее с липонлтрапсацетилазой. Связь эта непрочная и легко разрушается в процессе выделения и очистки пируватдегидрогеназного комплекса [327, 328, 329, 474, 549J. Стабильность связи повышается при наличии в среде кальция. Отсюда следует, что контролируемый кальцием процесс ассоциации-диссоциации комплекса фосфатаза — лииоилтрансацетилаза может являться одним из регуляторных механизмов клетки, обеспечивающим соответствующий уровень ферментативной активности пируватдегидрогеназного комплекса путем его фосфорилирования — дсфосфорилнрования за счет АТФ.
Интересно заметить, что активность другого регуляторного фермента киназы пируватдегидрогеназы, также повышается при взаимодействии с трансацетитазой, но лишь в два раза [259J. В противоположность фосфатазе киназа прочно связана с линоилтрансацетилазой [327J, и в образовании этого комплекса кальции, по-видимому, не участвует [383].
Некоторые свойства регуляторных ферментов, входящих в состав пируватдегидрогеназных
комплексов
