Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Активный центр данного фермента представляется в виде гидрофобного кармана (или выемки), образующегося в процессе взаимодействия апофермента с тиаминпирофосфатом и магнием за счет небольших локальных изменений третичной структуры белка [508, 509, 511, 518, 555]. Гщрофобность активного центра пируватдекарбоксилазы стабилизирует связь кофермента с апофер-ме.нтом, обеспечивает «вхождение» в активный центр субстрата и прикрепление последнего к белку за счет своей алкильной группы, а также предохраняет очень нуклеофильный, короткоживу тций а-карбанион оксиэтил-тнаминпирофосфата (XVIII)—предполагаемый промежуточный продукт пируватдекарбокенлазной реакции от взаимодействия с протоном среды [130, 131, 509, 511, 555]. Протоннрованнс а-карбаннона оксиэтилтиаминпирофос-фата приводило бы к образованию стабильного продук-
138
та (XIII), выключая тем самым а-карбаннон из нормального пути превращения иировиногра^ной кислоты.
Алкильная группа субстрата не только благоприятствует его связыванию в активном центре, по, по-виднмо-му, необходима и на дальнейших стадиях реакции, удерживая а-карбанион оксиэтилтиаминпирофосфата в гидрофобном «кармане» или повышая гидрофобность окружения этого промежуточного соединения. Другими словами — продлевает время его существования. Очевидно, именно по этой причине глиоксиловая кислота не является нормальным субстратом пируват-декарбоксилазы, как оетачьные а кетокислоты: хотя она и подвергается ферментативному декарбоксилированию, но продукт реакции не выделяется в среду в виде свободного формальдегида, а остается связанным с кофер-ментом [433]. Глиоксиловая кислота не имеет алкильной группы, поэтому после обычного протекания начальной стадии декарбоксилирования образующийся а-карбанион оксиметилтиаминпирофосфата, согласно вышеприведенным соображениям, быстро взаимодействует с ионом водорода среды, переходя в стабильную протонирован-ную форму [509, 515].
ФОРМИРОВАНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ТРАНСКЕТОЛАЗЫ
Кривая дисперсии оптического вращения апотранскетолазы, снятая в области 270—400 нм, имеет, на первый взгляд, плавный характер (рис. 33, кривая I). Такое впечатление, однако, может быть кажущимся, так как в этой области спектра (ниже 300 нм) очень высока оптическая активность пептидных групп белковой молекулы фермента. Действительно, в спектре циркулярного дихроизма апофермента обнаруживается явно выраженный положительный эффект Коттона с максимумом при 280 нм (рис. 34).
Добавление к апотранскетолазе тиаминпирофосфата и кальция (образуется холофермент) сопровождается выявлением аномалии на кривой дисперсии оптического вращения (рис. 33, кривая 2), что соответствует усилению положительного эффекта Коттона на кривой циркулярного дихроизма (см. рис. 34). Кальцин сам по себе,
139
Рис. 33. Спек гр дисперсии оптического вращения транскетолазы в 1-10-2 М трис-буфере pH 6,5 \282]
/ — апофермент; 2— холофер-мент
[&?]-10
-Z
Рис. 34. Изменение спектра циркулярного дихроизма апотраискетолазы при добавлении тнаминпнрофосфа-та и его аналогов [27]
/ — апофермент; 2— холофер-мент; 3 — апофермент + тиамин; 4 — апофермент + тнаминмоно-фосфат; 5 — апофермент + тия-золпнрофосфат. Условии, как на рис. 33
без кофермента, влияния на оптическую активность транскетолазы в исследуемой области спектра не оказывал.
Для многих белков показано, что эффекты Коттона, обнаруживаемые в области 260—300 нм, обусловлены наличием в белковой молекуле остатков триптофана и тирозина (оптическая активность дисульфидных связей проявляется обычно в более коротковолновой области спектра) [91].
Таким образом, положительный эффект Коттона с максимумом при 280 нм обусловлен наличием в молекуле транскетолазы остатка (или остатков) ароматической аминокислоты, являющейся центром асимметрии. При добавлении кофермента он лишь усиливается, в то время как общая форма пика циркулярного дихроизма и положение его максимума остаются по существу неизменными (сравни кривые для апо- и холофермента на рис. 34).
В спектре циркулярного дихроизма холофермента наряду с положительным эффектом Коттона, который был и в апоферменте, обнаруживается еще отрицательный эффект Коттона, которого в апоферменте не было (см. рис. 34). Его максимум находится при 320 нм, где ни кофермент, ни апофермент не имеют полос поглощения.
140
Рнс. 35. Спектры поглощения апотранскеюлазы, тнаминпирофосфа-т.') (ТПФ) и их смеси в МО-2 М трис-буфере, pH 6,5 [281]
а: I—ТПФ (I-10—s М), 2 — апофермент (1,8-10-® М) + кальций < 1 -10—3 М), 3 апофермент (1,810-* М) + кальций (1-10—3 М) ¦+¦ ТПФ (1-I0-® М), 4 — алгебраическая сумма кривых / н 2. Кювета—2 мм; 6: /— ТПФ (1,7-10-4 М), 2—апо-фермепт (1,1-10-* М) + кальций (1 -10—3 М), 3 — апофермент (1.1-10-* М) + кальций (I-10—3 М) 4- ТПФ (1,7-10-* М). 4 — алгебраическая сумма кривых / и 2. Кювета—10 мм: в: разностный спектр, полученный путем вычитания кривой 4 из кривой 3
Рис. 36. Спектры поглощения триптофана, тиаминпирофосфата и их смеси [281]
а: / — триптофан (2,5-10-* М). 2 — тиамиипирофосфат (4 10—* М). 3 — триптофан (2,5-10-* М) + тиамиипирофосфат (4-10-* М), 4 — алгебраическая сумма кривых / и 2. Кювета —2 мм, б: разностный спектр, полученный путем вычитания кривой 4 нз кривой 3. Условия те же, что иа рис. 35
