Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Существенное влияние природы буфера па величину каталитической активности (а также на положение оптимума pH ферментативной реакции) наблюдалось и при исследовании декарбоксилазной активности оксоглу-таратдегидрогеназного комплекса, выделенного из мозга быка [58].
Эксперименты, проводимые с различными буферами, представляют не только утилитарный интерес, позволяя выбрать оптимальные условия для измерения ферментативной активности, но и дают возможность в ряде случаев получить более полное представление о свойствах энзима. Подробнее мы на этом остановимся, когда будем рассматривать вопросы, связанные с регуляцией действия тиаминовых ферментов.
Глава четвертая СТРУКТУРА ТИАМИНОВЫХ ФЕРМЕНТОВ
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ВЕС II СУБЪЕДИНИЧНЛЯ СТРУКТУРА
Молекулярный вес транскстолазы шпината, определенный методами седнментаиионного равновесия и гель фильтрации, равен примерно 100000 [529]. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия обнаруживается одна белковая фракция с той же величиной молекулярного веса. Это указывает на то, что фермент состоит из одной полинептндной цепи.
Мол. вес траискетолазы пекарских дрожжей впервые определен Ченом и Уорнером и приведен в статье Датта и Рскера [135]. Работу проводили на ультрацентрифуге и использовался метод Арчибальда. Была получена величина 140000. В других работах, где использовали метод седимеитационного равновесия, приводятся такие значения мол. веса: 140000 [219], 159 000±6000 [2],
158 000±4000 [119]. В первых случаях исследования проводили с апоферментом, в последнем — с холоферментом.
При электрофорезе в полиакриламидном геле фермента, предварительно обработанного додецилсульфа-том натрия, обнаруживалась одна белковая фракция с молекулярным весом 60 000—70 000 [17, 219]. Методом седимеитационного равновесия в присутствии 6М гуани-динхлорида и 0,01 М р-меркаптоэтаиола получена величина 75 000±2000 [119].
Аналогичные результаты получены и в том случае, когда фермент помещали в сильно щелочную среду (pH 12). При этом молекулярный вес белковой фракции, определенный методом седимеитационного равновесия, равнялся примерно 80000 [2].
Таким образом, молекула траискетолазы состоит по крайней мере из двух субъединиц. Субъединицы эти.
46
очевидно, идентичны, что следует из экспериментальных данных, приведенных выше, и, кроме того, подтверждается результатами определения N концевых аминокислот. В качестве таковых в молекуле транскетолазы обнаружены только остатки аргинина (количественное их определение не проводили) [219].
Заметим, что распад фермента на субъединицы осуществлялся и в отсутствие р меркаитоэтанола. Это указывает на то, что дисульфндные связи не участвуют в образовании димерной формы фермента.
При исследовании влияния pH на четвертичную структуру транскетолазы отмечено следующее [2]. При pH 12 фермент полностью распадается на субъединицы, в то время как в интервале pH от 5,5 до 11 образования субъединиц практически не наблюдалось (во всяком случае, при концентрации белка в растворе, равной 0,2 мг/мл и выше). Так же влияет pH и на каталитическую активность транскетолазы [26]. В результате выдерживания фермента при pH 5—11 его активность (измеряемая в оптимальных условиях, при pH 7,6) изменяется незначительно. Даже после выдерживания при крайних значениях pH—5 и И—все еще сохраняется около 85% ее первоначальной величины. При pH 12—изменение всего на единицу по сравнению с pH 11—фермент инактивируется уж примерно на 60%. Это как раз те условия, при которых, как указывалось выше, происходит резкое нарушение четвертичной структуры транскетолазы и она полностью распадается на субъединицы. Отсюда напрашивается предположение о том, что субъединицы транскетолазы более лабильны, чем ее димерная форма, и резкое снижение стабильности фермента при pH выше 11 обусловлено его распадом на субъединицы.
Аналогичную корреляцию со снижением стабильности транскетолазы при pH ниже 5 исследовать не удалось, так как в этих условиях наблюдалась частичная агрегация фермента и поэтому невозможно интерпретировать экспериментальные данные [26].
Распад транскетолазы на субъединицы, который первоначально наблюдали при жестких воздействиях на фермент (в присутствии додецилсульфата натрия, гуанидинхлорида пли при высоких значениях pH), осуществляется и в обычных условиях (pH 7,6) при
47
H-W~3
Концентрация (смещение рринбжей), мкн
Рис. 3. Зависимость среднечисленного (M0i арр) и средневесового (Mw арр) молекулярного веса транскетолазы от ее концентрации [71] ‘
Нанесены средние величины по всем опытам. Эксперименты ставили при 20° в 5-I0-* М кзлнй-фосфатном буфере, pH 7,6 при 17980 об/мин н 16200 об/мин в 30 мм двухсекторной и 12 мм шестиканальной ячейках с начальными концентрациями белка 0,09, 1,25, 0.50 и 0,67 мгУмл
понижении исходной концентрации белка в исследуемом растворе (рис. 3). Данные, приведенные на рис. 3, указывают на то, что в данном случае мы имеем дело с обратимо диссоциирующей системой: димер^2 мономер. При наличии в срсде кофакторов указанное равновесие смещается влево [119].
