Тиаминовые ферменты - Кочетов Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Очень чувствительна к действию оксптиаминпирофос-фата транскетолаза пекарских дрожжей [134]. Уже при концентрации ингибитора, равной 3,6-10-8 М, 60% апо-фермента оказывалось заблокированным. Повышение
39
COi , мкл
Рис. 1. Влияние окситиаминпи-рофосфата на активность пируватдекарбоксилазы зародышей пшеницы [149]
/ — тиаминпирофосфат (без предварительной инкубации); 2 — тиаминпирофосфат (предварительно инкубировали с пируватдекарбоксилл-зой); 3 — как 2. только добавлен окситиаминпирофосфат; 4 — тиаминпирофосфат и окситиаминпирофосфат добавлены к пируватдекарбо-ксилазе одновременно; 5 — сначала добавлен окситиаминпирофосфат, а затем — тиаминпирофосфат; 6 — как 5, только концентрация тиаминпирофосфата в 25 раз выше
концентрации в два раза сопровождалось увеличением степени ингибирования до 80%. При одновременном добавлении к апотранскетолазе окситиаминпирофосфата и кофермента (в 1000-кратном избытке) снижение ферментативной активности все еще наблюдалось. Приведенные данные указывали на то, что аналог кофермента характеризуется очень высоким сродством к транскетолазе, значительно большим, чем сам кофермент. Это подтвердилось и в дальнейших экспериментах, которые ставили следующим образом [134].
Апотранскетолазу преинкубировалн при комнатной температуре с насыщающей концентрацией тиаминпирофосфата. Добавляли насыщенный раствор сульфата аммония. Образовавшийся осадок промывали раствором сульфата аммония 70% степени насыщения, растворяли в буфере и использовали для работы. Полученный таким образом препарат фермента для проявления максимальной активности не требовал добавления кофакторов извне, т. е. он был полностью представлен холофермен-том. Активность его практически не изменялась в течение 4 ч. Если к такому холоферменту добавить окситиаминпирофосфат (1,2-10~5М), то наблюдается прогрессивное падение транскетолазной активности и к четвертому часу остается лишь 25% от исходной. Следовательно, ингибитор достаточно легко иытесияет кофермент из холотрапскетолазы. Обратный процесс — вытеснение ингибитора из его связи с апоферментом идет
40
гораздо медленнее и даже в присутствии 1500-кратпого (по отношению к окситиаминпирофосфату) избытка кофермента активность за 3 ч восстанавливается лишь на 20%.
Все тиаминовые ферменты катализируют расщепление —С—С связи субстрата (за одним исключением, о котором шла речь в главе I) и требуют для своего действия один и тот же кофермент — тиаминпирофосфат. Это предполагает много общего в их свойствах, особенно в механизме ферментативного катализа, во всяком случае — на начальных его этапах. С другой стороны, они действуют на разные субстраты, осуществляя в конечном счете различные их превращения — простое декарбоксилирование, окислительное декарбоксилирование, трансферазные реакции — и поэтому должны иметь индивидуальные различия, специфику, характерную для того или иного фермента. Это положение хорошо иллюстрируется на примере их ингибирования аналогом кофермента — окснтиаминпирофосфатом.
Действительно, как указывалось выше, и пнруват-декарбоксилаза и транскетолаза, катализирующие, соответственно, простое декарбоксилирование пирувата и перенос двууглеродного фрагмента с кетосахаров на альдосахара, чувствительны к ингибирующему действию окситнамннпирофосфата. Однако с количественной точки зрения наблюдаются существенные различия. Это выражается в том, что с апотранскетолазой ингибитор связывается намного легче, чем с апопируватдекарбо-ксилазой, и труднее вытесняется коферментом. Более того, для пируватдекарбоксилазы взаимодействие кофермента с апоферментом осуществляется в несколько раз быстрее, если последний был предварительно заингнби-рован окснтиаминпирофосфатом [433]. По-видимому, ингибитор, связавшись в активном центре, таким образом меняет его структуру, что она становится благоприятной для последующего присоединения кофермента (ингибитор при этом, естественно, отщепляется). В то же время вытеснение окситиаминпирофосфата из его связи с апотранскетолазой осуществляется крайне медленно, даже при использовании очень высоких концентраций кофермента [134].
В последующем изложении мы еще не раз коснемся различий и сходства в структуре и функции тиаминовых ферментов,
41
Е/т
Рис. 2. Влияние бромннрувата на ферментатипную активность пируватдекарбоксилазного ком' понента нируватдегидрогеназ* лого комплекса Е. coli [338]
1 — без добавок: 2 — тнаминпиро-
фосфат; 3 — тиамиипирофосфат + + бромпируват; 4 — бромпир>ват
Преинкубация, ми»
Ингибирование аналогом субстрата. Ферментативная активность пируватдегидрогеназного комплекса нз Е. coli, измеренная в полной системе по количеству образующегося ацетнл-КоА или восстановленного НАД, существенно снижается в присутствии бромпирувата [158, 338]. Почти полное ингибирование осуществляется за 13 мин при концентрации бромпирувата, равной МО-3 А1. Необходимое условие при этом — наличие в системе тиаминпирофосфата. Без него падение активности хотя и наблюдается, но со значительно меньшей скоростью. Ингибирование бромпируватом, по-видимому, необратимо, так как пропускание заингибированного комплекса через сефадекс не сопровождается восстановлением его каталитических свойств.
