Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
влияние растворителя на ширину полос. (Birks J.B., Photophysics of
Aromatic Molecules, New York, Wiley, 1970, p. 117.).
ного перевести молекулу в состояние Sv практически все молекулы в
растворе будут пребывать в основном электронном состоянии S0. Характерная
величина разности энергий двух колебательных уровней составляет 10 ккал ¦
моль- *, что также превышает тепловую энергию. Поэтому с хорошей
точностью можно считать, что заселен лишь нижний из колебательных уровней
состояния S0. Однако врашательные уровни отстоят друг от друга на
величину порядка 1 ккал • моль-1 и меньше, и, следовательно, многие из
них оказываются заселенными.
При поглощении света соответствующей частоты молекула возбуждается и
переходит на один из вращательно-колебательных подуровней электронного
состояния S,. Таким
образом, в отсутствие прочих эффектов мы должны получить спектр,
состоящий из
СПЕКТРОСКОПИЯ ПОГЛОЩЕНИЯ
23
огромного числа близко расположенных узких линий. Интенсивность каждой из
этих линий будет определяться величиной момента перехода <51кол _врIIS0>,
где 5, кол вр - волновая функция, отвечающая данному колебательно-
вращательному уровню состояния Sp a S0 - волновая функция основного
состояния. Однако на самом деле эти линии оказываются довольно широкими,
в результате чего спектр имеет внд размытых полос, представляющих собой
огибающую отдельных линий (рис. 7.2). Уширение линий происходит из-за
неоднородности окружения, доплеровского смещения и по ряду других причин.
В результате вопреки нашим ожиданиям спектр оказывается весьма
невыразительным. Правда, несмотря на потерю значительной доли информации,
он обладает неким преимуществом, состоящим в том, что при интерпретации
спектров мы можем не рассматривать каждое вращательно-колебательное
состояние по отдельности и моделировать спектр при помощи небольшого
числа широких электронных полос (7.2,А), как правило подбирая их форму
эмпирически. В некоторых специальных случаях (таких, как разреженные газы
или особые молекулярные матрицы при очень низких температурах) все же
удается получить узкие спектральные линии даже для больших молекул
(Birks, 1970).
КОЭФФИЦИЕНТ экстинкции
На рис. 7.3,А схематически изображены установки для измерения поглощения
света. Падающий свет обладает интенсивностью /0 при длине волны X. Его
путь в образце (обычно это раствор поглощающих молекул некоторой
концентрации С, выражаемой в молях на литр) равен I см. Свет, прошедший
через образец, имеет интенсивность /.
Рассмотрим слой образца, перпендикулярный направлению распространения
света. Толщину слоя dl выберем достаточно малой, так чтобы интенсивность
света в пределах слоя можно было считать постоянной. Тогда доля
поглощения света (-dl/I) будет пропорциональна числу поглощающих молекул:
-dl/I = Се' dl (7-32)
Источник
света
Монохроматор
Образен
Детектор Усилитель Самописец
РИС. 7.3. Схематическое изображение установок для измерения поглощения
света. А. Измерение поглощения света. Б Регистрация разностных спектров.
24
ГЛАВА 7
где е' - коэффициент пропорциональности, именуемый коэффициентом молярной
экс-тинкции. В случае невзаимодействующих молекул величина е' не зависит
от их концентрации, однако,являясь функцией длины волны, меняется с
изменением частоты света. Интегрируя уравнение (7.32) (интеграл в левой
части берется в пределах от начальной интенсивности /0 до конечной /, а в
правой - от нуля до /)¦ найдем
In (/"//) = Ce'l (7.33)
Переходя к логарифму по основанию 10, получим закон Ламберта - Бэра в его
общепринятой форме:
-4(A) = lg (/0//) = С?(А)1 (7.34.)
где е = е' /2,303. Величина А называется оптической плотностью образца.
Измерение спектра поглощения обычно имеет своей целью определение
величины е. Максимальные значения етах и длины волны, при которых они
наблюдаются (Х-^), табулируются. Значения етах для разных хромофоров
варьируют от 1 М-1 • см до более чем 105 М-1 ¦ см -1 (см. Дополнение
7.2).
Наиболее точно величину А удается измерить в том случае, если она лежит в
интервале от 0,1 до 2. При/1 < 0,1 образец поглощает лишь ничтожную долю
падающего света, если же А превышает 2, это означает, что на детектор
падает очень мало света. Для хромофоров с emax = 104М ~1 •
см "1 (таких, как основания нуклеиновых кислот) из уравнения
(7.34) получаем, что молярную концентрацию образца толщиной 1 см следует
выбирать в пределах от 10"5 до 10-4.
В случае макромолекул часто бывает неудобно использовать молярную
экстинкцию. Это связано либо с тем, что ее значение очень велико, либо с
тем, что мы не знаем молекулярную массу полимера. Поэтому на практике
обычно пользуются величиной экстинк-ции, приходящейся на один моль
мономерных звеньев. Например, для полинуклеотидов концентрацию выражают
как суммарное число молей фосфатов в одном литре. В научной литературе
эти две величины нередко путают. К счастью, в большинстве случаев
экстинк-ция в расчете иа моль макромолекул отличается от экстинкции,
