Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
колонках с внутренним диаметром 4 мм самое лучшее разделение достигается
при объемных скоростях до 0,25 мл/мин. Пример такого разделения приведен
на рис. 4.31.
При таких низких объемных скоростях длительность анализа составляет от
2 до 3 ч. Обнаружение белка в элюате проводится по поглощению в УФ-
области при 280 нм, а ферменты обнаруживают по ферментативной активности,
в основном при помощи специфического для данного фермента реакционного
детектора [268].
Рис. 4.30. Разделение изоферментов лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) методом
анионообмениой хроматографии [2771.
Неподвижная фаза: синхро-пак АХ-300; элюент: 0,02 М трис-ацетат (pH
7,9)/0,02 М трис-ацетат, 0,4 М ацетат натрия (pH 7,9), градиентное
элюирование.
о 5 ю 15 20 25
t, мин
Аминокислоты, пептиды, белки 2л
В работе [248] описан новый тип ионообменной неподвижной фазы на
основе силикагеля, покрытого слоем полиэтиленимина. В этом материале
применен силикагель с еще большим размером пор - от 1000 до 4000 А.
Значительно более толстый слой полиэтиленимина химически связан с
поверхностью силикагеля, что повысило ионообменную емкость и
эффективность разрешения. Селективность разделения, как установлено,
зависит от размера пор. Однако пока неподвижные фазы этого типа изучены
слабо. В продажу они не поступают.
Относительно недавно было выдвинуто предложение проводить разделение
белков на сильном катионообменнике на основе силикагеля, получившем
название партисил SCX. Авторы работы [281] изучили разделение на
партисиле SCX меченных радиоактивными изотопами карбоан-гидразы, [5-
лактоглобулина и высокомолекулярного трансформирующего фактора роста
[281]. Элюирование проводилось буферной системой пиридин/ацетат аммония в
градиентном режиме при pH от 2,5 до pH 6,0. Радиоактивность получаемых
фракций элюата контролировалась. Особенно хорошее разделение н высокие
выходы были получены при повышенной температуре.
Рис. 4.31. Разделение коммерческого овальбумииа методом анионообменной
хроматографии при различных объемных скоростях [278].
Неподвижная фаза: синхропак АХ-300; элюат; 0,2 М трис-ацетат, (pH
8,0)/0,2 А1 трис-ацетат, 0,5 М ацетат натрия (pH 8,0).
t, мин
t.MHH
Т.МИН
30
t,4
50
t.4
t,4
Рис. 4.32. Сравнение ВЭЖХ и и классической ионообменной хроматографии
[345].
Неподвижная фаза (колонка): а - КМ-целлюлоза (150X9 мм), б - ультрапак
TSK 535 КМ (150X7,5 мм), в - ДЭАЭ-биогсль (120X10 мм), г - ультрапак TSK
545 ДЭАЭ (15X7,5 мм); элюент: а и б- градиентный режим, 0,02 М ацетат
аммония 8 М мочевина (pH 5,0)/0.02 М ацетат аммония. 8 М мочевина (pH
5.0), 0,1 М хлорид натрия, вне - градиент, 0 02 М бикарбонат аммония/0,2
М бикарбонат аммония.
'
Аминокислоты, пептиды, белки 237
В последние несколько лет в продажу поступили новые ионообменные
неподвижные фазы на основе силикагеля, разработанные фирмами SynChrom,
Pharmacia и Toyo Soda Corporation. Однако мы пока располагаем всего лишь
несколькими публикациями, описывающими свойства этих фаз. Ионообмен-ники
TSK, ДЭАЭ и КМ выпускаются с двумя различными размерами пор - 130 и 240
А. Сравнение фазы TSK и классических ионообменных неподвижных фаз
показало [345] огромное преимущество первых (рис. 4.32). Хорошее
разделение на ионооб-менпиках TSK было получено также авторами работ
[403, 415],
Совершенно иным типом неорганического материала для ионообменной ВЭЖХ
является гидроксилапатит, или фосфат кальция. На материале этого типа
успешно проведено разделение производных цитохрома с.
Ряд чисто органических ионообменников для ВЭЖХ разработан на основе
метакрилата. Некоторые из имеющихся в продаже материалов различного типа,
в том числе ряд замещенных сферонов, биорекс 70 и амберлит CG-50 были
использованы для разделения белков. Авторы работ [283-285] синтезировали
карбоксиметил-, фосфо-, сульфо- и диэтиламиноэтилпроизвод-ные сфероиа
300, которые в дальнейшем использовали для проведения большого числа
разделений (табл. 4.5). Согласно данным работы [283], предел эксклюзии
сферона 300 составляет 500 000. Одно из важных достоинств ионообменников
на основе сферона - их высокая химическая стойкость при экстремальных
значениях pH. Количество белка, которое можно разделить на ионообменниках
на основе сферона, по-видимому, несколько выше рекомендованного для
колонок того же размера с син-хропаком АХ-300. Согласно наблюдениям
Микеша, с ионообменников на основе сферона порядок элюирования белков
соответствует их изоэлектрическим точкам. Это доказывает, что разделение
белков в этом случае осуществляется по ионообменному механизму, хотя
сферой более гидрофобен, чем целлюлоза и полидекстраны, что может
привести к образованию гидрофобных связей с белками [283]. Ионообменники
