Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Однако послеколоночная модификация с нингидрином и флуо-рескамином
позволяет улучшить обнаружение. Предел обнаружения составляет около 10
пмоль. Отдельные буферные растворы, допускающие обнаружение по поглощению
в УФ-области, описаны в табл. 4.4. Большинство буферных систем содержит
нелетучие компоненты, исключение составляет система, содержащая ацетат
пиридина. Выход пептидов при разделении по этой методике составляет от 50
до 80%.
4.2.2.3. Разделение диастереомеров пептидов. Особой проблемой в
хроматографии пептидов является разделение диа-
Аминокислоты, пептиды, белки 221
стереомеров пептидов, которые отличаются друг от друга только
конформацией входящих в их состав остатков аминокислот. Природные
пептиды, образующиеся при считывании нуклеотидной последовательности,
состоят только из l-аминокислот, так. как только эти кислоты кодируются
генетически. Однако известно, что когда пептиды образуются по другим
биологическим механизмам, в этом случае в их состав могут входить и D-
аминокислоты. При проведении органического синтеза пептидов D-
аминокислоты могут быть введены умышленно с с целью модификации их
свойств или случайно в результате' рацемизации аминокислот в процессе
синтеза.
Поскольку диастереомеры пептидов отличаются друг от друга по
химическим, физическим и биологическим свойствам, их анализ и раздельное
получение представляют собой важную задачу. До разработки методов ВЭЖХ
этой цели достигали путем воздействия на о - и ь-пептиды различными
специфическими протеолитическими ферментами или оксидазами аминокислот
либо путем модификации компонентов кислотных гидролизатов специальными
энантиомерными реагентами (см. энан-тиомерные аминокислоты). В настоящее
время диастереомеры можно эффективно разделять при помощи обращеино-
фазовой ВЭЖХ на фазах Cis или CN [161-164] или методом ионообменной ВЭЖХ
[160].
Подробное изучение разделения диастереомеров проведено на примере
дипептидов. Так, при тщательном подборе подвижной фазы смесь dl, DL-
дипептидов можно разделить на два пика, один из которых соответствует и.-
и dd-изомерам, а другой - ld- и DL-изомерам. Порядок элюирования этих
пиков зависит от типа элюента и неподвижной фазы. В работах [161, 163]
описано, в каких условиях удается разделить многие-из диастереомеров
нонапептида окситоцина.
4.2.3. Модифицированные пептиды
В настоящее время опубликовано всего лишь несколько работ,, в которых
описано разделение модифицированных пептидов методом ВЭЖХ. Пептиды
модифицируют по различным причинам: предколоночная модификация позволяет
увеличить чувствительность обнаружения, может предшествовать масс-
спектрометрическому анализу и может проводиться в целях пептидного
синтеза.
Модификация пептидов диметилазобензолизотиоцианатом (ДАБИТЦ; ср. с
модифицированными аминокислотами) была предложена [165, 166] с целью
улучшения предела обнаружения пептидов и смещения длины волны, на которой
проводится обнаружение, в область, свободную от влияния растворителя.
Образующиеся ДАБТГ-производные пептидов можно разделять
222 Глава 4
t, МИН
Рис. 4.25. Разделение ДАБТК-производиых пептидов трипсинового гидролизата
(20 пмоль) методом обращенно-фазовой хроматографии [166].
Неподвижная фаза: ji-бондапак Си; элюент: градиент, 0,5%-ный пиридин, pH
7,0, установлено уксусной кислотой, 2%-ный диметилформамид, 0,005%-ный
меркаптоэтанол, 10- 80%-ный ацетоннтрил за 40 мнн; температура: 22 °С.
методом обращенно-фазовой хроматографии на фазах С is, используя в
качестве элюеита смесь ацетата пиридина/диметил-формамид/ацетонитрил.
Отличные так называемые пептидные карты получаются даже для малых
количеств (20 пмоль) смеси пептидов (рис. 4.25). Обнаружение
осуществляется при длине волны 436 нм. Выход большинства пептидов был
достаточно высок, и пептиды, содержащиеся в отдельных фракциях,
полученных при разделении, можно сразу анализировать с целью выявления
аминокислотной последовательности предпочтительно в виде ДАБИТЦ-
производных.
Для определения аминокислотной последовательности методом прямой масс-
спектрометрии чаще всего используются N-ацетилированные-перметилированные
олигопептиды. Авторы работы [167] продемонстрировали возможность
разделения этих производных пептидов иа октилсиликагелевой неподвижной
фазе в системе для непрерывного ВЭЖХ-масс-спектрометриче-ского анализа
[167]. На начальной стадии этого эксперимента пептиды, содержащие от 2 до
5 аминокислотных остатков, разделяли в водно-ацетонитрильной системе.
Аминокислоты, пептиды, белки 223
В пептидном синтезе ВЭЖХ применялась для очистки и получения
количественных характеристик пептидов с введенными защитными группами
[168-170]. Пептиды с более чем 30 аминокислотными остатками, содержащие
различные защитные группы, были разделены на колонках с различными
силикаге-левыми неподвижными фазами и фазой Cie.
4.3. Белки
4.3.1. Введение
Как уже отмечалось, принципиального различия между белками и крупными
