Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
на основе сферона сохраняют устойчивость при высоких объемных скоростях и
давлениях [283]. Хорошее разделение, как показывает рис. 4.33, может быть
достигнуто в течение одного часа. Поступающие в продажу ионообменники на
основе сферона 1000 отличаются от использованного Микешем и сотрудниками
тем, что их предел эксклюзии равен 1 000 000, что соответствует размеру
пор 370 А [283]. Однако размеры чистиц сферона довольно велики - около 20
мкм.
Новым многообещающим типом ионообменников на органической основе
является ДЭАЭ-тойоперл, который очень устойчив к действию буферных систем
с экстремальным значением pH, высоким объемным скоростям и давлениям.
Авторы работ [400,
?
I
6
50 ?
О
0
1 CD 5 >-
S?
25 <
0
0 20 40 60
Рис. 4.33. Разделение технической глкжозоксидазы методом анионообменной
хроматографии [2661.
Неподвижная фаза: ДЭАЭ-сферон; элюент: Л-0,01 М ацетат натрня (pH 6,8), Б
- 0,3 М ацетат натрня (pH 5,5). В -0,3 М ацетат натрня, 0,1 М хлорид
натрня (pH 5,5).
403] выполнили на нем большое число разделений белков с хорошим
разрешением и выходами. Однако размер частиц этого ионообменника очень
велик: от 20 до 30 мкм.
Свойства нежестких катионообменников биорекс 70 и амбер-лит CG-50
рассматривают авторы работ [282, 286]. Для описанных ими целей эти
неподвижные фазы вполне подходят. Однако использование этих материалов
создает определенные проблемы, так как они недостаточно механически
устойчивы и так как поступающие в продажу образцы имеют большой размер
частиц.
4.3.5. Гель-проникающая хроматография
В идеале в процессе гель-проникающей хроматографии белковые молекулы
разделяются в соответствии с величиной гидродинамического объема. Самые
большие молекулы практически не включаются в поры геля, средние
распределяются по порам в соответствии с молекулярным объемом, а
маленькие целиком включаются в поры. На практике, однако, различного рода
взаимодействия между молекулами белка и поверхностью неподвижной фазы
нарушают этот идеальный механизм. Так, заряженная поверхность неподвижной
фазы в зависимости от заряда белковой молекулы вызывает ионную сорбцию
или ионную эксклюзию. Гидрофобная поверхность вызывает гидрофобную
сорбцию, а в ряде случаев и денатурацию белков,
Классические материалы для гель-проникающей хроматографии типа
сшитого декстрана, агарозы и полиакриламида слишком мягки для ВЭЖХ.
Первыми жесткими носителями, использованными для разделения белков, были
силикагели и стекло
Глава 4
Аминокислоты, пептиды, белки 239
Таблица 4.6. Неподвижные фазы для гель-проникающей хроматографии
Диа Диапазон разделения, относитель
Размер ная молекулярная массаХЮ-8
Неподвижная фаза частиц, пор. для 6М
мкм О для обыч для
А ных буферов гуанидин- 0,1%-ного
НС1 bDb
TSK 2000 SW или TSK-125 10 130 0,5---60 1---25 15---25
TSK 3000 SW или TSK-250 10 240 1---300 2---70 10---100
TSK 4000 SW или TSK-400 13 450 5---1000 3---400 15---300
TSK 3000 PW или TSK 30 13 200 До 300
TSK 4000 PW или TSK 40 13 До 1000
TSK 5000 PW или TSK 50 17 10---10000
TSK ЬООО PW 17 До 30 ООО
Тойоперл или фрактогель Г 5---40 0,1 --- 10
HW 40
Тойоперл или фрактогель 25---40 0,5---200
HW 50
Тойоперл или фрактогель 25---40 1 --- 1000
HW 55
1 --- 60 10 60 1---20
I --- 125 10 125 2---80
1 --- 250 10 250 10---500
Лихросорб диол 5 или 10 10---10
Синхропак QPC-100 10 100 5---500
Синхропак QPC-500 10 500 10---3000
с контролируемым размером пор, однако имеющиеся на их поверхности
