Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
системе Chromatospac Prep 100 [74]. Как показано на рис. 3.37, внизу
колонки помещен поршень, который может передвигаться вверх под действием
сжатого воздуха. Неподвижную фазу загружают в колонку в виде суспензии,
когда поршень находится в нижнем положении. После этого колонку сверху
закрывают, перемещающийся вверх поршень сжимает носитель, удаляя избыток
растворителя. Далее
164 Глава 3
на колонку наносят пробу и проводят разделение. Помимо более плотной и
однородной упаковки колонки такая система имеет еще одно преимущество.
Разделенные фракции не обязательно полностью элюировать из колонки. Как
только первая фракция начинает элюироваться из колонки, элюирование
прекращают, верхний ограничитель удаляют и выталкивают носитель из
колонки. Содержащиеся в носителе фракции легко обнаружить при помощи УФ-
лампы. После чего те из них, которые представляют интерес, можно отделить
и экстрагировать. Эта методика, напоминающая методику хроматографического
разделения, примененную М. С. Цветом, экономит растворитель и время,
необходимое для проведения эксперимента. В таких системах обычно
используют колонки размером 10Х Х100 см, объемная скорость составляет от
20 до 100 мл/мин, а масса пробы - от 1 до 100 г на одно нанесение.
Область Б на рис. 3.36 представляет собой область получения особо
чистых соединений, например для последующего синтеза или биологических
испытаний. В этом случае необходима неподвижная фаза с более высокой
разрешающей способностью и меньшим размером частиц, что соответствует
промежуточной области между обычной и высокоэффективной жидкостной
хроматографией. Размеры колонок ограничивает высокая стоимость
неподвижной фазы и растворителей. Типичные параметры: колонка 50X2,5 см,
объемная скорость от 50 до 250 мл/мин, масса пробы 50 мг на один цикл.
Такие системы, выпускаемые промышленно, в ряде случаев снабжаются
автоматическим устройством повторного ввода пробы, системой непрерывного
контроля элюата и коллектором фракций.
Примером прибора, работающего в этом диапазоне, может служить Waters
Prep LC/System 500, схема потоков растворителя в котором показана на рис.
3.38. Неподвижная фаза содержится в предварительно заполненных
полиэтиленовых патронах, которые помещаются в специальную камеру и
сжимаются в радиальном направлении давлением, создаваемым подвижной
фазой, с целью получения колонки с более плотной и однородной структурой
носителя. Рефрактометр служит монитором, обеспечивающим обнаружение всех
элюируемых соединений.
Область В - это область полупрепаративной жидкостной хроматографии, в
которой аналитические методы разделения масштабированы таким образом, что
аналитические приборы используются для препаративных разделений;
полностью реализуются разделительные возможности аналитической колонки;
метод применяется для получения требуемых количеств вещества
соответствующей чистоты для проведения идентификации вещества всеми
возможными способами и установления 1то структуры. Физико-химические
методы анализа и необхо-
Рис. 3.38. Диаграмма потоков растворителя в хроматографе Waters Prep
LC/System 500 (с разрешения Waters Ass. Co.).
ir 100 10 1мг 100 10
1МКГ
Физические и ямр^^с ФТ ЯМР ик.
УФ,масс- Маскпентрометрий
Биологические элементный
слеитрометрия
исследования анализ высокого
разрешения
Рис. 3.39. Размеры проб, необходимые для идентификации соединений.
Рис. 3.40. Схема потоков растворителя в аналитическом жидкостном
хроматографе, оборудованном приспособлениями для проведения
препаративного разделения (с разрешения Hewlett-Packard Company).
/-резервуар для раствори-теля; 2- насос; 3- смеси* тельная камера; 4 -
система ввода проб; 5 - колонка; 6 - детектор; 7 - коллектор фракций.
166 Глава 3
Рис. 3.41. Система ввода проб для
препаративного разделения.
/ - 6-канальиый край; 2 - капилляр для
образца; 3 - шприц для заполнения капил* ляра; 4-подача растворителя от
насоса; 5 - колонка.
димые для их проведения количества вещества указаны на рис. 3.39.
На рис. 3.40 показана схема потоков растворителя в Hewlett Packard
1084В Analytical High Pressure Liguid Chromatograph, к которому для
выполнения препаративных разделений добавлены следующие узлы:
препаративная система ввода пробы, препаративная колонка, коллектор
фракций и система автоматического контроля ввода пробы и коллектора
фракций.
Система ввода проб представляет собой 6-канальный кран, к которому
подключен капилляр для хранения образца (рис. 3.41). В положении,
изображенном на рисунке (сплошные линии), капилляр, объем которого может
достигать 50 мл, можно заполнять при помощи шприца. В этом случае
растворитель, подаваемый насосом, поступает непосредственно на колонку.
