Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
скнх кислот (включая предваритель- новых кислот (включая предварительное
фракционирование). ное фракционирование).
если концентрация изучаемых кислот в нем невелика. Эффективное
предварительное фракционирование проводится при помощи препаративной ТСХ
[36, 55] и ВЭЖХ [55]. Схемы, приведенные на рис. 13.1 и 13.2,
иллюстрируют общие методы предварительного фракционирования органических
кислот на основе препаративной ТСХ для последующего анализа с помощью ГХ
(рис. 13.1) и предварительного фракционирования оксокарбо-новых кислот,
необходимого для защиты карбонильных групп (рис. 13.2),
Метод предварительного фракционирования заключается в следующем. Смесь
метиловых эфиров органических кислот (или О-метилоксиметилированных
эфиров) разделяют на четыре (или большее число) фракций на пластинках для
ТСХ (20Х Х20 см) со слоем кизельгеля 60 F254- С этой целью пробу наносят
на левую сторону пластинки в виде полосы длиной 13 см. На правую сторону
наносят стандартную смесь, например смесь метилстеарата,
метилфенилацетата, метилиндолбутирата иди-метилтартрата. Пластинку
обрабатывают последовательно двумя смесями растворителей. Первой из них
(н-гептан/диэтиловый эфир/хлороформ, 40:30:30) дают подняться до верхнего
края
Органические кислоты в организме человека 619
пластинки, после чего отмечают положение метилиндолбутира-та (УФ-лампа,
254 нм). Далее пластинку обрабатывают второй смесью растворителей
(циклогексан/хлороформ/метанол, 40:55: : 5) и дают ей подняться до метки,
соответствующей метилин-долбутирату. После этого левую часть пластинки
закрывают, а правую опрыскивают 2,7-дихлорфлуоресцеином, чтобы можно было
обнаружить соединения, входящие в стандартную смесь (366 нм).
Исходя из положения соединений стандартной смеси, левую часть
пластинки делят на четыре зоны: зона между метилстеа-ратом и
метилфенилацетатом - фракция 1, зона между метил-фенилацетатом и
метилиндолбутиратом - фракция 2, зона между метилиндолбутиратом и
диметилтартратом - фракция 3, зона между диметилтартратом и стартовой
линией - фракция 4. Каждую из четырех фракций вырезают и экстрагируют 12
ч ди-хлорметаном в непрерывном режиме в аппарате Сокслета. Фракция 1
содержит в основном жирные кислоты, фракция 2 - дикарбоновые кислоты,
производные оксокарбоновых кислот и ароматические кислоты, фракция 3 -
гидроксикарбоновые, ароматические и азотсодержащие кислоты и кислые
конъюгаты, фракция 4 - кислые конъюгаты.
13.2.4. Разделение и обнаружение
Как было отмечено выше, для хроматографического анализа органических
кислот можно применять ВЭЖХ и ГХ. При выборе хроматографического метода
необходимо иметь в виду следующее. ВЭЖХ экономит время и затраты труда
(по сравнению с ГХ), поскольку методика подготовки пробы к анализу более
проста. Стадию получения производных обычно можно опустить,
предварительное фракционирование также может не потребоваться, так как
обнаружение некоторых классов кислот в принципе более специфично, чем при
разделении методом ГХ. ВЭЖХ позволяет осуществлять достаточно точный
количественный анализ органических кислот. Таким образом, ВЭЖХ пригодна
для рутинного количественного анализа ряда органических кислот и кислот с
высокой температурой кипения, анализ которых методом ГХ затруднен.
Достоинство ГХ как метода анализа кислот состоит в том, что она
допускает возможность исследования более сложного спектра органических
кислот, включая те, которые непросто обнаруживать при разделении при
помощи ВЭЖХ. В то же время селективность детекторов, используемых в ВЭЖХ,
ограничивает их применение. Эффективность разделения кислот методом
капиллярной ГХ обычно выше, чем при применении ВЭЖХ. Кроме того,
сочетание с масс-спектрометрией более характерно для ГХ. Поэтому к ГХ
прибегают в тех случаях, если необходимо
40*
620 Глава 13
детально исследовать состав органических кислот, не поддающихся
обнаружению методами, принятыми в ВЭЖХ, или если обнаружение необходимо
осуществлять масс-спектрометрически. Поскольку селективность ГХ-анализа
обычно ниже, чем у ВЭЖХ, то, чтобы повысить ее, следует пользоваться
специальными детекторами, например термоионным для обнаружения
азотсодержащих соединений, или масс-спектрометром, позволяющим
идентифицировать соединения по отдельным его фрагментам.
Разделение органических кислот чаще всего проводится методом
обращенно-фазовой ВЭЖХ. Этим способом обычно определяют отдельные кислоты
или смеси небольшого числа различных кислот. Хорошие результаты получены
при разделении и количественном определении метаболитов биогенных аминов,
содержащихся в моче и спинномозговой жидкости, в частности 5-
гидроксииндол-З-уксусной [7, 16, 20, 28, 66, 67], ванилилмин-дальной [17,
67, 68], ванилиновой [67, 69], гомованилиновой [9, 17, 67, 70] и 3,4-
дигидроксифенилуксусной [19] кислот. В некоторых случаях разделяются
смеси аминокислот и аминов или метаболитов гликоля, например З-метокси-4-
гидроксифенил-гликоля [8, 19, 69, 71-72]. Исследование превращения
