Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
свободных стероидов и их конъюгатов проходило в следующем порядке:
дегидроэпиандростерон, эпиандростерон, этиохоланолон и анд-ростерон.
Стероиды, содержащие экваториальную гидроксильную группу, как правило,
более полярны, чем стероиды, содержащие аксиальную гидроксильную группу.
Обращенно-фазовая хроматография может быть также использована для
препаративного разделения андростанов. Так,
34*
$32 Глава 11
на колонке с лихросорбом RP-18 проведено успешное разделение 7а- и 7р-
метилпроизводных 17[}-ацетоксиандрост-4-ен-3-она и побочных продуктов,
образующихся при реакции 17^-ацето-ксиандроста-4,6-диен-3-она с
диметилкупратом лития [14].
Отличное разделение андрогенов возможно также методом адсорбционной
ВЭЖХ (рис. 11.4) [20].
Д4-3-Кетоны (III, VII и IX на рис. 11.4) сильно поглощают при 254 нм,
что позволяет определить до 30 нг тестостерона при этой длине волны.
Обнаружение 17-кетостероидов проводят в основном при длине волны 280 нм;
однако чувствительность обнаружения в этом случае в 5 раз меньше
чувствительности обнаружения Д4-3-кетонов. Как следует из рис. 11.4, С^-
стероиды можно разделить на три следующие группы, элюирующиеся друг за
другом из адсорбционной хроматографической колонки: 1) дикетоны
(соединения I-III), 2) З-гидрокси-17-кетоны (соединения IV-VII) и 3) 17-
гидрокси-З-кетоны (соединения IX и XI). Более того, как известно,
эпимерные стероиды разделяются лучше методом адсорбционной хроматографии,
чем обра-щенно-фазовой распределительной хроматографии, исключение
составляют лишь 17-эпимеры [21].
11.3. Эстрогены
Эстрогены - женские половые гормоны с ароматическим кольцом А в молекуле.
Структура некоторых эстрогенов представлена на рис. 11.5.
Вследствие того что эстрогены сильно поглощают в УФ-об-ласти,
сообщения об их разделении методом ВЭЖХ появились в литературе
сравнительно рано [22]. Эстрогены и их производные были разделены как
методом адсорбционной (зорбакс BP-SIL, ц,-порасил, корасил 1, партисил 5
[23-26]), так и об-ращенно-фазовой (зорбакс BP-ODS, ц-бондапак Cis,
лихросорб RP-8, сферисорб S5-ODS [26-32]) хроматографии. В табл. 11.2
сравниваются результаты, полученные при разделении природных эстрогенов
на адсорбционных и обращенно-фазовых ВЭЖХ-колонках. Исходя из приведенных
в таблице данных, можно ¦сделать следующие выводы.
При разделении методом ВЭЖХ наиболее важную роль играют число и
расположение гидроксильных групп в эстрогенах.
Введение кетогруппы в молекулу эстрогена значительно меньше
увеличивает ее полярность в адсорбционной хроматографии по сравнению с
обращенно-фазовой.
Эпимерные эстрогены при помощи адсорбционной хроматографии
разделяются лучше, чем при использовании обращенно-фазовой хроматографии.
Порядок элюирования экстрогенов из обращенно-фазовой колонки не
представляет собой обратную последовательность
Стероидные гормоны 533
он
..он
ой
он
СИ
Рис. 11.5. Структуры некоторых эстрогенов.
1 - эстрадиол; 2 -эстрон; 3 -эстриол; 4 - 16-эпиэстриол; 5 - 16.17-
эпиэстриол; 6 - С-кетоэстрадиол; 7 - 2-гндрокснэстратриол; 8 - ба-
гидроксиэстратриол.
элюирования из адсорбционной колонки; следовательно, эти два метода
дополняют друг друга.
Полярность гидроксильных групп в положениях Ct6 и С!7 возрастает в
ряду 17а< 17^< 1ба< 16^.
6-Кетоэстрадиол более полярен, чем 16-кетоэстрадиол, при разделении
методом адсорбционной хроматографии и меиее полярен, если разделение
проводится методом обращенно-фазовой хроматографии.
Авторы работы [33-36] выполнили ряд детальных исследований процесса
разделения конъюгатов эстрогенов методом ВЭЖХ с использованием колонок с
ионообменной целлюлозой [33], ц-партисилом 10-SAX [34], лихросфером Si-
100 [35] или лихросорбом RP-2 (RP-18) [36]. Наиболее обстоятельные
исследования по применению ионообменных целлюлоз для разделения
глюкуронидов, сульфатов и фосфатов эстрогенов выполнены ван дер Валом и
Губером [33]. Свойства ряда ионообменных целлюлоз приведены в табл. 11.3.
Степень хроматографического разделения двух компонентов
характеризуется разрешением /?, которое зависит от парамет-
534 Глава И
Таблица 11.2. Время удерживания (мин) эстрогенов при разделении
различными вариантами метода ВЭЖХ {26]
Колонка: 250X4,6 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: зорбакс BP-SIL
(А, Б) н зорбакс BP-ODS (В, Г) (7-8 мкм); элюент: к-гексаи/этаиол (-4-
9:1, ? - 97 : J) и аце-тонитрнл/вода (В -35 : 65, Г - 25 : 75); объемная
скорость: 2 мл/мин; обнаружение: по поглощению при 280 нм; проба, мкг
эстрогенов/50 мкл элюеита: 1,5-10 (Л,), 1-10 (Б), 1-3 (В), 1-5 (Г)
Соединение А Б В г
Моиоспирты
17-Дезоксоэстрон 3,25 >75
Эстрон 9,5 32
