Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
красные лепестки 19,3 18,5 9,6 25,0 4,7
Мозг крысы6 - ¦--- ¦--- 15,1 ---
(r) мкмоль/г (144),
7.5. Фосфолипиды и гликолипиды
Фосфолипиды и гликолипиды в основном относятся к диглицеридам, которые
существенно различаются по длине цепей, входящих в них жирных кислот. Эти
липиды играют важную физиологическую роль, являясь компонентами
биологически активных мембран, например фотосинтезирующих мембран
растений, нервных клеток животных и человека (табл. 7.5). В фосфо- и
гликолипидах аминоспирт сфингозин может быть связан с жирными кислотами,
а не с глицерином. Сфингозины содержатся в растительных тканях в очень
малых количествах, тогда как в животных тканях - это один из основных
компонентов. Плазмалогены - фосфолипиды, содержащие простые винильные
эфирные связи вместо сложноэфирных, входят в состав нервных тканей.
Точное определение качественного и количественного состава фосфо- и
гликолипидов играет важную роль в биологии, медицине и сельском
хозяйстве, поскольку характеризует изменения, вызываемые заболеваниями
или изменениями внешних условий. Поэтому биологи, медики и агрохимики в
последнее время проявляют большой интерес к ВЭЖХ как методу анализа
мембранных липидов вообще и фосфолипидов в частности.
Методы количественного анализа фосфо- и гликолипидов при помощи ВЭЖХ
рассмотрены в обзоре [88].
7.5.1. Фосфолипиды
Фосфолипиды могут быть подвергнуты разделению как в нативном виде, так и
в виде производных. Обнаружение и количественное определение липидов в
виде дифенилкарбонильных производных или нитробензоатов легко осуществить
при помощи УФ-детектора при длине волны ~260 нм. Однако модифици-
Липиды 407
и животных тканях3
<3>Э ФИ ФС ФК ДФГ ПЭПА СП
30,5 7,1 0,4 1,3
9,7 3,7 1,8 --- 0,3 ---
26,3 3,0 2,9 --- --- ---
19,8 0,5 1,7 ¦--- --- ---
7,4 1,4 4,7 1,0 0,6 15,8 3,7
рованию могут подвергаться отнюдь не все фосфолипиды, кроме того,
проведение требует дополнительных затрат времени, тогда как
немодифицированные фосфолипиды можно обнаруживать по поглощению при 205
нм. Ненасыщенные фосфолипиды характеризуются высоким коэффициентом
поглощения при 205 нм, а насыщенные - низким. Следует, однако, отметить,
что получаемые на хроматограммах немодифицированных фосфолипидов
отдельные пики обычно соответствуют не индивидуальным соединениям, а
смесям фосфолипидов с насыщенной или ненасыщенной жирнокислотной группой.
Поэтому количественное определение немодифицированных липидов осуществить
сложно, и если некоторые искусственные смеси липидов и удается разделить
полностью, то провести такое разделение сложных смесей природных липидов
не представляется возможным.
7.5.1.1. Методы получения производных фосфолипидов. Для
модифицирования фосфолипидов, содержащих первичную аминогруппу,
например фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфати-дилсерина (ФС), их
лизопроизводных (ЛФЭ), (ЛФС) или соответствующих плазмалогенов используют
4-бифенилкарбонил-хлорид [89]. Бифенилкарбониллипиды имеют максимум
поглощения при 269 нм, их коэффициент поглощения равен 2,3-104 см2/моль.
Предел обнаружения составляет 0,3-0,4 нг, а диапазон линейности
соответствует интервалу от 10 пМ до 20 нМ. Разделение производных липидов
было осуществлено на колонке с микропаком SI-10 при элюировании смесью
дихлорметан/метанол/МН4ОН (92 : 8 : 1 или 80 : 15 : 3).
Другой метод получения производных (превращение моно-или
диглицеридов в их я-нитробензоаты) требует больших затрат времени, но
пригоден для всех фосфолипидов. Коммерческие препараты фосфолипазы С
применяют для ферментативного превращения фосфолипидов в 1,2-диглицериды
[90].
408
Глава 7
Рис. 7.16. Разделение п-нитробен-зоатов диглицеридов [90]. Неподвижная
фаза: брауили RP-18
(10 мкм); элюент: изопропаиол/ацето-
нитрил (35:64); объемная скорость; 1 мл/мин; обнаружение: при 254 им.
1 - 1,2-ди-(12 : 0); 2- 1,2-ди-<16 : 1) (9); 3 - 2,2-ди-(14 : 0);4 -
1,3-дИ-(!8 : 1) (И); 5- 1,2-ди-(18 ; 1) (11); 6-1,2-ди-
(16:0); 7- 1-(18 : 0)-2-(18 : I); 8 -
1,2-ди-(18 : 0).
Бензоаты липидов и даже некоторые "молекулярные виды" липидов были
разделены на колонке с обращенной фазой Cis при элюировании смесью
изопропанол/ацетонитрил (35 : 65 по объему) и обнаружении УФ-детектором
(254 нм), предел обнаружения составил 1 нмоль (~0,6 мкг). На рис. 7.16
приведен пример разделения 1,2-дилаурата, 1,2-димиристата, 1,2-дипаль-
митата, 1,2-дистеарата и ряда других соединений.
Очень чувствительный метод обнаружения фосфолипидов путем введения
метки 32Р был с успехом применен для выявления микроколичеств липидов в
крови и клетках дрожжей [91]. Меченые липиды вводили на колонку с
лихросорбом SI-60 и элюировали в градиентном режиме смесью
хлороформ/пропанол/уксусная кислота/вода. Обнаружение проводили
настольным жидкостным сцинтилляционным счетчиком (рис. 7.17).
Элюирование смесями пропанол/толуол/уксусная кисло-та/НгО и
