Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
ацетонитрил/вода. Жирные кислоты с короткой цепью перед разделением
предварительно трифтора-цетилируют, чтобы увеличить длину их цепи.
Обнаружение не-модифицированных гидроксикислот жирного ряда проводят при
234 нм [63], коэффициент поглощения составляет около 2,8• 104 см2/моль.
Интересно отметить, что продукты химического или ферментативного
(липоксигеназного [64, 65]) разложения жирных кислот, в частности
линоленовой кислоты, разделяют при помощи ВЭЖХ [66-68]. В литературе
опубликовано много других примеров разделения жирных кислот (см.,
например, табл. 7.4).
7.4. Глицериды (моно-, ди- и триглицериды)
Глицериды можно разделить в соответствии с их принадлежностью к различным
классам липидов без учета их степени не-насыщенности или числа атомов
углерода или же в соответствии с "молекулярным видом" входящих в них
групп. В первом случае моно-, ди- и триглицериды (МГ, ДГ, ТГ) образуют
три отдельные гомогенные зоны, содержащие чрезвычайно разнообразную смесь
"молекулярных видов", разделить которые чрезвычайно трудно как при помощи
ВЭЖХ, так и при помощи ГХ. В большинстве работ описывается разделение,
осуществляемое в пределах одного класса липидов (чаще всего
триглицеридов), в соответствии с числом атомов углерода.
Хроматографирование глицеридов ведется как на обращенных, так и на
полярных неподвижных фазах. Для обнаружения использу-
Рис. 7.9. Разделение бромфенилациловых эфиров жирных кислот [61].
Колонка: две последовательно соединенные колонки, (30 см), заполненные
пораснлом С3); элюент: градиентное элюирование (выпуклый градиент) от
смесн ацетонитрил/НгО (2 : 3) до ацетоиитрнла (150 мин) и далее от
ацетоиитрила до диоксаиа (150 мин) (линейный градиент); объемная
скорость: 1 мл/мнн; обнаружение: по поглощению при 254 им; разделяемые
кислоты: от С 3 : 10 до С 24 : 0.
34 - брассндиновая (22:1); 32 - ернаииовая (22:1): 27 - элаидниовая
(18:1); 26 - ваценнновая (18:1); 14- а- (18:3); 15 - V- (18:3); 20 -
лннолневая (18:2); 22 - лннолелаиднновая (18:2).
Рис. 7.10, Разделение метоксифеннлациловых эфиров а- и [S-
гидроксипроизводиых жирных кислот [62].
Колонки: две последовательно соединенные колонки, 30 см, заполненные
бондапаком С-18; элюент: ацетонитрил/Н20, градиентное элюирование от
40:60 до 100% ацетонитрала, 3 Ч; объемная скорость: 1 мл/мии;
температура: 38 °С- обнаружение: по поглощению при 254 нм.
r rJ
Липиды 401
ется пламенно-ионизационный (с движущейся проволокой) или
рефрактометрический детектор. Предел обнаружения первым равен ---0,5-2
мкг, предел обнаружения вторым составляет 50 мкг. Осуществить полное
разделение всех "молекулярных видов" в настоящее время не представляется
возможным.
7.4.1. Глицериды различных классов
Все сказанное выше относительно разделения моно-, ди- и триглицеридов
справедливо также применительно к нескольким другим классам глицеридов.
Авторы работы [77] разделили липиды соевых бобов на 29 соединений,
включая триглицериды, фосфо- и галактолипиды (два последних в виде смеси
с диглицеридами), стиролы, цереброзиды и т. д. (рис. 7.11) на колонке с
партисилом II при программируемом элюировании пентаном, пентан/диэтиловый
эфир, хлороформ/метанол/МН4ОН и обнаружении пламенно-ионнзационным
детектором с движущейся проволокой [2, 77].
В работе [3] описано разделение технических препаратов липидов,
содержащих ТГ, 1,2-ДТ, 1,3-ДГ и МГ, на колонке с лих-росорбом SI-60,
длительность которого составила 15 мин. При элюировании системой
растворителей ССЦ/изооктан (34:66), хлороформ/диоксан/гексан (40:11:49),
хлоро-форм/метанол/диизопропиловый эфир (34 : 36 : 30) кроме ДГ были
также выделены свободные жирные кислоты, углеводороды, сквален,
холестерины и их эфиры (рис. 7.12).
7.4.2. "Молекулярные виды"
Разделение по "молекулярным видам" в рамках липидов одного класса,
отличающихся числом атомов углерода в жирной цепи, осуществляют при
помощи хроматографии на обращенной фазе в изократическом режиме. Для
обнаружения используют рефрактометрический детектор (рис. 7.13а). Между
логарифмом времени удерживания (log ^r) и числом атомов углерода (рис.
7.136), а также числом двойных связей (при одном и том же числе атомов
углерода) существует линейная зависимость (рис. 7.13в) [44].
Каждая добавочная двойная связь уменьшает время удерживания, то же
самое наблюдается и при снижении числа атомов углерода. Например, время
удерживания триолеата и три-пальмитата совпадает, и разделить их
невозможно. Наличие в молекуле гидрокси- или эпоксигрупп уменьшает время
удерживания, причем сильнее, чем двойные связи. Авторы работы [78]
обнаружили линейную зависимость между коэффициентом
26-1489
Рис. 7.11. Разделение липидов незрелых соевых бобов [77].
Неподвижная фаза: порасил II; элюент: состав н режим элюирования указаны
на рисунке; обнаружение: ПИД.
1-3 - углеводороды, воски и т. д. и неидентифицнрованные соединения; 4,
