Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
для нанесения новой неподвижной жидкой фазы.
Жидко-жидкостную распределительную хроматографию применяют для
разделения стероидов [38, 39], кислот и их производных [40], фосфолипидов
[41], нуклеозидов и их азотистых оснований [42], а также в ряде других
случаев.
Для распределительной хроматографии пригодны полярные неподвижные
жидкие фазы. Между распределительной хроматографией и хроматографией на
обращенной фазе наблюдается аналогия: компоненты элюента распределяются
между жидкой и твердой фазами (это характерно, например, для элюентов на
основе водно-метанольных смесей, содержащих добавки неполярных веществ -
тетрагидрофурана, дихлорметана и др., см. разд. 2.2.4.2). В разд 2.2.5.1.
обсуждены принципы ион-парной распределительной хроматографии. Разделение
сахаров с помощью распределительной хроматографии на неподвижной фазе с
привитыми аминогруппами и при элюировании смесью ацетонитрил ¦-вода
обсуждено в разд. 2.2.9.2.
2.2.3.5. Влияние структуры и свойств соединений на разде-
ление. Применение неподвижных фаз на основе силикагеля в настоящее время
должно быть ограничено разделением соединений, растворимых в органических
растворителях. Конечно, в таких системах возможно разделение и ряда более
полярных соединений, но во многих случаях разделение проходит более
эффективно на химически привитых фазах на основе силикагеля. Силикагель
обеспечивает наибольшую селективность при разделении соединений, имеющих
различные функциональные группы и различное число таких групп. В первом
приближении можно считать, что каждая группа вносит определенный вклад в
удерживание, причем чем выше полярность группы, тем больше этот вклад
(-Н<-ЫОг<-COOR< = CO<-ОН<
<-ЫНг<-СООН) [33]. Результаты разделения замещенных изомеров бензола,
например различных нитрофенолов, - наглядная иллюстрация возможностей
хроматографии на силикагеле. Стерические и резонансные эффекты могут
усиливать удерживание на "кислотной" поверхности силикагелей или,
напротив, ослаблять его. Стероиды с экваториальным расположением
замещающих групп адсорбируются на силикагеле более прочно, чем при их
аксиальном расположении.
2.2.3.6. Разделение сложных смесей. Градиентное элюирование. Сложные
смеси, компоненты которых существенно раз-
42 Глава 2
личаются по коэффициентам емкости, невозможно разделить в течение
приемлемого периода времени, если проводить элюирование одной и той же
смесью растворителей при постоянных, т. е. изократических, условиях. Для
одинаково хорошего разделения слабо и сильно удерживаемых компонентов и
получения хорошо различимых пиков состав элюента необходимо постоянно
менять. Программируемое увеличение "силы" растворителя, или, иными
словами, градиентное элюирование, увеличивает скорость разделения, но
ухудшает разрешение (которое, впрочем, в большинстве случаев остается на
достаточно высоком уровне). Градиентное элюирование обеспечивает
оптимальные условия элюирования каждого из компонентов смеси.
Принципиальной проблемой, препятствующей широкому распространению
градиентного элюирования при разделении на силикагеле-вых неподвижных
фазах, является медленное установление равновесия при изменении состава
элюента. Если разделение осуществляется на химически привитых фазах,
равновесие устанавливается гораздо быстрее. Вследствие важности и
сложности этого вопроса он будет отдельно рассмотрен в разд. 2.2.7.
2.2.4. Обращенно-фазовая хроматография (ОФХ)
Путем проведения соответствующих химических реакций с поверхностными
силанольными группами можно изменить хроматографические свойства
силикагеля. Если привитые группы не предопределяют какой-либо
специфической причины изменения селективности разделения, коэффициент
емкости вновь полученной неподвижной фазы меньше, чем у
немодифицированного силикагеля. Однако это справедливо только для одних и
тех же неполярных элюентов. Более полезные свойства химически привитых
фаз проявляются при использовании полярных элюентов, поскольку в этих
условиях неполярная неподвижная фаза приобретает селективность,
обусловленную гидрофобным взаимодействием. Поскольку в таких системах
происходит "обращение" свойств фаз, т. е. неподвижная фаза становится
неполярной, а подвижная - полярной, то они получили название обращенно-
фазовых систем. (Хотя лучше было бы называть их системами с неполярной
неподвижной фазой.)
Привитую группу модифицируют путем введения в ее состав различных
функциональных групп, вследствие чего изменяется селективность
неподвижной фазы. Свойства и возможности применения таких неподвижных фаз
будут рассмотрены в других разделах (при обсуждении ионообменной, гель-
эксклюзион-ной хроматографии и т. д.). Разделение на химически привитых
фазах дает определенные преимущества по сравнению с
Хроматографическая колонка 43
разделением на силикагеле или при помощи распределительной хроматографии:
равновесие в системе колонка - элюент устанавливается быстро, градиентное
