Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Изменить относительное удерживание при элюировании вод-но-
метанольными растворами можно, добавляя в элюент второй органический
компонент [54, 55, 58], например дихлорметан или тетрагидрофуран. На
обращенной фазе сорбируется неполярный компонент элюента (при содержании
метанола 50%), и свойства получаемой фазы отличаются от исходной. На рис.
2.14 показано влияние добавок второго органического компонента в элюент
на разделение фенилтиогидантоиновых производных аминокислот [59].
Следует отметить, что выбор элюента и оптимизация условий разделения
- задача достаточно сложная, особенно для тех, кто лишь начинает
заниматься ВЭЖХ. Наиболее быстрый способ выбора оптимального
изократического состава элюента- это проведение градиентного элюирования
(см. разд.
Хроматографическая колонка ЬЗ
2.2.7.2). В литературе описаны и другие способы оптимизации состава
элюента [60-62]. Во всяком случае, целесообразно провести предварительное
разделение при элюировании стандартными смесями элюентов, например
вода/метанол, вода/ацетонитрил, вода/ТГФ.
Состав элюента следует менять до тех пор, пока не будет достигнуто
удовлетворительное значение коэффициента емкости. Далее следует
попытаться вводить в элюент различные органические компоненты,
различающиеся донорно-акцептор-ной способностью или дипольным
взаимодействием. Такая процедура оптимизации дает очевидные результаты,
если известны все компоненты разделяемой смеси. Вне зависимости от метода
оптимизации интерпретация получаемых результатов затруднена, если не
известно число компонентов, содержащихся в разделяемой смеси. В такой
ситуации, чтобы установить, происходит или не происходит перекрывание
пиков, для их дифференциации необходима дополнительная информация.
До сих пор речь шла только об оптимизации состава элюента,
предназначенного для разделения соединений, не диссоциирующих на ионы. В
тех случаях, когда предстоит осуществить разделение кислот или
оснований,необходима дополнительная оптимизация состава элюента. Варианты
решения такой проблемы рассмотрены на примере разделения двух изомерных
аристолоховых кислот - производных нитрофенантренкарбоновой кислоты (рис.
2.15). При элюировании чистым метанолом изомеры разделяются лишь частично
со слабым запаздыванием. В соответствии со сказанным выше можно было бы
ожидать, что добавление в элюент 20% метанола увеличит удерживание и
улучшит разделение. Однако кислоты элюируются перед инертной пробой и не
проникают в поры неподвижной фазы. Причиной тому служит наличие внутри
пор непрореагировавших, но диссоциированных силанольных групп, создающих
доннанов-
Рис. 2.14. Тройные элюирующие смеси. Разделение феиил-тиогидантоиновых
производных аминокислот [59].
54 Глава 2
Объемная скорость Ът/ти Рььемная скорость 2мл/тн
Рис. 2.15. Эксклюзия и удерживание при разделении в обращенно-фазовой'
хроматографии аристолоховых кислот [50].
/ - инертное соединение, 2,3 - изомерные кислоты.
ский потенциал [63]. Добавление в элюент 1% уксусной кислоты подавляет
диссоциацию как силанольных, так и карбоксильных групп, что приводит к
увеличению удерживания карбоновых кислот и их разделению.
Силанольные группы могут взаимодействовать с соединениями,
обладающими основными свойствами по ионообменному механизму. Это
нежелательное в данном случае взаимодействие предотвращают путем
добавления в элюент соединений с основными свойствами или солей. Рис.
2.16 показывает, как велико влияние добавок триэтиламина (ТЭА) в
концентрации порядка 10~4 % на эффективность разделения соединений с
сильноосновными свойствами.
Проблемы, связанные с образованием хвостов у пиков основных или
кислотных соединений, характерны не только для ВЭЖХ, они знакомы всем,
кто имеет дело с бумажной и тонкослойной хроматографией. Чтобы избежать
их образования, в подвижную или неподвижную фазу следует ввести кислотные
или основные добавки.
Добавлением в элюент нейтральных солей можно свести до минимума
влияние силанольных групп на характер элюирования способных к диссоциации
растворенных соединений. Эти добавки увеличивают полярность элюента и в
результате увеличивают коэффициент емкости неполярных органических
молекул. Такое "высаливание" органических соединений на неподвижной фазе
можно использовать для выбора необходимого времени удерживания (см. разд.
2.2.5 и 2.2.6).
Хроматографическая колонка 55
0.03% ТЭА
0,01% ТЗА
В приведенных выше примерах минимизация влияния процесса диссоциации
силанольных групп на результаты разделения достигалась на основе закона
действующих масс (вследствие увеличения содержания в элюенте органических
или неорганических электролитов). К уменьшению диссоциации приводит также
добавление в элюент органических кислот или оснований, обладающих большей
гидрофобностью.
В последнем случае может происходить образование ионных пар и разделение
будет осуществляться по ионному механизму (что сопровождается изменением
