Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.3.2. Определение титра
Стандартный метод для определения инфекционности вирусного препарата — метод отдельных бляшек, описанный в табл. 1. Подходящие разведения вируса инкубируют в течение нескольких дней с монослоем клеток. После окрашивания выявляются инфицированные участки монослоя, где клетки подверглись дегенерации и отслоились (бляшки). Учитывая разведение, при
Таблица 1. Определение титра вирусного препарата
1. Дайте препарату оттаять. Диспергируйте агрегировавшие обломки клеток путем обработки ультразвуком средней интенсивности (ультразвуковой дезинтегратор с водяной баней; Megasonic 80 Кс).
2. Добавьте 0,1 объема раствора трипсина (2,5 мг/мл) (Difco, Trypsin 1 : 250) и инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.
3. Приготовьте серию 10-кратных разведений1* вируса в растворе Хенкса + 0,1 % BSA (от англ. bovine serum, albumin — бычий сывороточный альбумин) при 25 °С.
4. Удалите среду культивирования с только что сформировавшейся монослойной культуры подходящей линии клеток. В качестве клеток-хозяев для титрования можно использовать CV1, BS1, Vero или RK13. Промойте культуру один раз PBS и подсушите монослой.
5. Нанесите на клеточный монослой разведение вируса в малом объеме (0,5 на монослой, выращенный на 6 см чашке или 0,15 мл на 1,5 см2 монослой, выращенный в 24-луночном планшете) и инкубируйте при 37 °С в течение 1—2 ч.
6. Удалите вирусный инокулят, добавьте к клеткам подходящую среду (с учетом требований, предъявляемых данным клеточным типам), содержащую 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS), и инкубируйте клетки при 37 °С в течение 36—48 ч.
') Чтобы снизить вероятность случайной ошибки, следует приготовить дублирующие разведения и каждое разведение титровать на нескольких монослоях; для определения титра вирусного препарата оптимальное количество бляшек на одном монослое — приблизительно 100.
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
471
котором получено данное количество бляшек, и считая, что каждая бляшка образована потомством одной инфекционной вирусной частицы, нетрудно определить титр препарата. Эту величину выражают обычно числом бляшкообразующих единиц в 1 мл (б.о.е./мл). Следует иметь в виду, что титр одного и того же препарата вируса может отличаться в 5 раз в зависимости от вида используемых для титрования клеток.
2.3.3. Получение и очистка вирусных препаратов
После того как удалось идентифицировать рекомбинантный вирус, мы обычно дважды очищаем его, рассевая до отдельных бляшек, и лишь затем приступаем к пробному наращиванию. Процедура очистки вируса методом отдельных бляшек описана в табл. 2. Методика опирается на тот факт, что каждая вирусная бляшка образована потомством одной инфекционной вирусной частицы. Процедура получения небольших количеств вируса описана в табл. 3. Для наращивания вируса в препаративных количествах (табл. 4) рекомендуем использовать клетки HeLa, адаптированные к суспензионному культивированию.
Таблица 2. Очистка вируса методом отдельных бляшек
1. Выполните пункты 1—5 методики определения титра вирусного препарата (табл. 1).
2. Удалите вирусный инокулят и залейте монослой минимальной средой Игла (МЕМ), содержащей 1% агара1» и 5% фетальной сыворотки. Если необходимы какие-либо добавки для создания селективных условий, их можно ввести в агарозный слой. Инкубируйте при 37 °С в течение 36—48 ч.
3. Окрасьте клетки: поверх агарозного слоя нанесите слой 1%-ной агарозы, содержащей 0,1% нейтрального красного. Инкубируйте при 37 °С в течение нескольких часов, чтобы визуализировать вирусные бляшки; последние проявляются как прозрачные зоны в окрашенном монослое, поскольку только живые клетки включают нейтральный красный.
4. Отберите хорошо изолированные бляшки при помощи пастеровской пипетки с маленькой резиновой грушей. Для этого проткните агарозу точно над выбранной бляшкой до монослоя и втяните в пипетку агарозную пробку. При этом большая часть инфицированной зоны монослоя останется связанной с агарозой.
5. Перенесите этот кусочек агарозы с инфицированными клетками в А,5 мл МЕМ.
6. Выделите вирусные частицы из монослоя путем трехкратного повторения цикла замораживания — оттаивания. Это удобно сделать, помещая пробирку попеременно в спиртовую баню с сухим льдом и в теплую водяную баню. Обычно одна вирусная бляшка содержит от 104 до 105 б. о. е.
7. Для повторной очистки вируса повторите стадии 3—5 из табл. 1 и затем стадии 2—6 настоящей методики.
'¦) Мы показали, что для некоторых клеточных лниий, культивируемых иа селективных средах, применение 1%-ной легкоплавкой агарозы дает лучшие результаты.
472
Глава 7
Таблица 3. Получение небольших количеств вируса_______________
1. Половину общего количества вирусных частиц, полученных из индивидуальной бляшки (стадия 6 табл. 2), используйте для инфицирования небольшой монослойной культуры (25 см2), только что достигшей стадии монослоя (стадия 4 и 5 табл. 1).
