Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
30*
468
Глава 7
2.2. Создание плазмидных инсерционных векторов
Сейчас известны нуклеотидные последовательности нескользких генов (и их промоторных областей) вируса осповакцины [5]. Эта информация позволила разработать несколько плаз-мидных инсерционных векторов, которые с минимальным числом манипуляций можно использовать для клонирования и экспрессии генов в вирусе осповакцины. На рис. 3 показаны схемы трех таких векторов. Эти плазмиды содержат различные уникальные
Рис. 3. Плазмидные инсерционные векторы. Обобщенная схема плазмидного инсерционного вектора показана вверху слева; рММ4, pGS20 и pLTPl—конкретные примеры плазмидных инсерционных векторов. Отличительной чертой этих векторов является присутствие промотора вируса осповакцины, располагающегося непосредственно перед группой уникальных рестрикционных сайтов (полилинкером). Промотор и состыкованный с ним полилинкер фланкированы последовательностями вирусной ДНК, взятыми из несущественных для развития вируса областей его генома. Ген устойчивости к ампициллину (Атрг) и бактериальная область начала репликации (ori) позволяют амплифицировать векторные плазмиды в клетках Е. coli. Плазмида рММ4 содержит промотор гена tk; pGS20 — промотор раннего вирусного гена, кодирующего полипептид с молекулярной массой 7,5К; pLTPl—промотор позднего вирусного гена, локализованного в WwdlllL — фрагменте (J. Weir, личное сообщение). На схеме показаны уникальные рестрикционные сайты для клонирования чужеродных генов под контролем вирусного промотора. Внутренние стрелки указывают локализацию и направление транскрипции вирусного гена тимидинкиназы. Внешние стрелки указывают транскрипционную ориентацию транслоцирован-»ных промоторов. Детальное описание рММ4 и pGS20 приведено в работе [12].
Вирусным
он . „ 0rt
HincII Ншс
Orl
Ori
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
469
сайты рестрикции, расположенные группой непосредственно за вирусным промотором, который транслоцирован в центр вирусного гена tk. Таким образом, любая непрерывная кодирующая последовательность может быть встроена рядом с вирусным промотором. Потенциальные проблемы, связанные с нарушением рамки считывания или с синтезом составных белков, можно преодолеть, комбинируя в составе единой конструкции область инициации транскрипции вирусного промотора и инициирующий трансляцию кодон чужеродного гена. После трансфекции инфицированных вирусом дикого типа клеток инсер-ционным вектором, содержащим кодирующую последовательность чужеродного гена, 7’/<|_-вирусы отбирают на ТЬ(--клетках, проводя селекцию бляшек в присутствии BUdR. Значительная часть ТК~-вирусов, отобранных таким способом, представляет собой рекомбинантов, экспрессирующих чужеродный ген. Как мы уже говорили, чужеродную ДНК можно вводить и в другие несущественные области вирусного генома. Для этого необходимо, чтобы интересующий ген был фланкирован последовательностями, гомологичными этим областям. В то же время введение чужеродных генов в другие области генома не обеспечивает появления фенотипического маркера, который мог бы служить объектом селекции. Относительно несложно также, используя синтетические линкеры, вводить новые рестрикционные сайты за промоторами в уже известных инсерционных векторах. Так, с помощью синтетических линкеров в сайт Smal вектора pGS20 (рис. 3) был введен новый сайт Xhol. Это оказалось весьма полезным для клонирования в вирусе осповакцины нескольких генов, кодирующие зоны которых выщепляются рестриктазами Xhol или Sail. Подобная стратегия конструирования, предполагающая транслокацию промотора и расположенного за ним полилинкера в «тело» гена tk, по-видимому, окажется эффективной и в случае использования других вирусных промоторов, когда таковые будут охарактеризованы. В связи с этим особый интерес представляют промоторы поздних структурных генов вируса. Поздние гены кодируют наиболее богато представленные вирусные белки, поэтому есть надежда получить более высокий уровень экспрессии чужеродного гена, если поставить его под контроль такого промотора.
2.3. Культивирование и очистка вируса осповакцины
Традиционно вирус осповакцины наращивали и выделяли из хориоаллантоиса 12-дневных куриных эмбрионов. В целом же большинство культивируемых клеточных линий способно обеспечить развитие этого вируса. Клетки почки обезьяны, линии BScl, CV1 и Vero широко использовали для пассирования вируса или получения его в препаративных количествах. Для полу-
470
Глава 7
чения больших количеств вируса, по-видимому, более всего подходят суспензионные культуры HeLa S3; суспензионные культуры К,В также дают неплохие результаты. Монослойные культуры HeLa, MRC5, фибробласты куриных эмбрионов, RK13, ВНК и мышиные L-клетки могут использоваться для наращивания вируса.
2.3.1. Вирусные штаммы
В литературе описаны сотни штаммов вируса осповакцины. Наиболее широко известны штаммы IHD, Lister (Elstree) (вакцинный штамм), WR, Copenhagen и Wyeth (вакцинный штамм США). В последнее время большинство работ выполняются на штамме WR, хотя все перечисленные штаммы дают хороший выход вируса.
