Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Перечисленные методы и экспериментальные подходы были использованы в работе с трансформированными растительными тканями, растениями, регенерированными из этих тканей, и с потомством F1, полученным от этих регенерированных растений [30].
5.1. Определение октопин- и нопалин-синтазы
Эти реакции разработаны Оттеном и Шилперортом [37]; с их помощью удается продемонстрировать наличие октопин-или нопалин-синтазы в небольших образцах растительной ткани.
Схематически реакции можно записать следующим образом:
OCS
аргинин + пируват+ЫаОН —> октопин + NAD
nos
аргинин+кетоглутарат-f-NaDN ¦—> нопалин +NAD
В действительности оба фермента предпочитают NADPH вместо NADH, однако NADPH в отличие от NADH в высокой концентрации ингибирует их активность; в реакции же используется именно высокая концентрация, поскольку многие другие ферменты, присутствующие в тканевом экстракте, конкурируют за эти кофакторы. Экспериментальная процедура описана в табл. 29; рис. 11 иллюстрирует определение октопин-синтазы.
Можно проводить совместное определение октопин-и нопалин-синтазы, используя смесь равных частей OCS- и NOS-буферов (см. примечания 2 и 3 к табл. 29). В некоторых случаях определение активности NOS бывает затруднено вследствие аккумулирования в ткани эндогенного нопалина. Нопалин удаляют на микроколонке с сефадексом G100.
1. Возьмите 0,75 мл микроцентрифужную пробирку и проколите дно тонкой иглой.
2. Положите на дно пробирки немного силиконированной стекловаты и заполните пробирку набухшим сефадексом G100.
Генетическая инженерия растений
373
1 2а Ь За Ъ4а Ь5а Ьб а Ь7а Ь 8
arg
oct
Старт
Рис. 11. Электрофореграмма, демонстрирующая наличие OCS-активности в некоторых трансформированных in vitro колониях P. parodii+pTiAch5. Дорожка 1 — аргининовый и октопиновый стандарты; 2 — аутентичный корончатый галл P. parorf«+pTiAch5; 3 — нетрансформированные клетки P. parodii\ 4—7 — гормоннезависимые трансформанты P. parodii\ 8 — аргининовый стандарт.
(a) Экстракты после ночной инкубации в присутствии 100 мМ аргинина.
(b) То же, что (а), но в экстракты добавлен аутентичный октопин. В левой крайней дорожке видны стартовые точки октопинового (oct) и аргининового
(arg) стандартов.
3. Поместите пробирку с сефадексом в 1,5 мл микроцентри-фужную пробирку и центрифугируйте в течение 1 мин на малой скорости в настольной центрифуге, снабженной бакет-ротором.
4. Удалите элюат, нанесите 50 мкл растительного экстракта и повторите центрифугирование. Элюат будет обладать NOS-активностью, но не будет содержать нопалина.
Процедура, описанная в табл. 29, имеет ряд недостатков. Так, концентрацию раствора NADH необходимо проверять перед использованием. Некоторые компоненты реакционной смеси для определения октопин-синтазы конденсируются в продукты, обладающие такой же подвижностью, как и октопин, что приводит к ошибочному выводу о наличии ферментативной активности. Приготовление растворов занимает очень много времени. Ниже
ЩГ
• vW
374
Глава 4
Таблица 29. Определение октопин- и нопалин-синтазы
1. Поместите примерно 10 мг растительной ткани в микроцентрифужную пробирку и определите точный вес образца. Добавьте равный объем буфера для экстракции1) и разотрите ткань на льду стеклянной палочкой.
2. Центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 2 мин в холодной комнате (4°С) и снова поместите пробирку на лед. Не оставляйте экстракты на льду дольше 15 мин до постановки реакции, так как энзиматическая активность быстро снижается. В то же время ткань или экстракт можно заморозить без существенной потери энзиматической активности.
3. Прилейте равный объем надосадочной жидкости к OCS- или NOS-бу-феру2). з) (например, 5+5мкл) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30—60 мин.
4. Нанесите 5 мкл реакционной смеси в точку на бумаге ЗММ (Whatman) или MN2I4 (Machereg Nagel, 516 Duren, FRG). Рядом нанесите маркер — метиленовый зеленый. Образцы следует наносить на расстоянии 6 см от края бумажной полосы, имеющей в длину 20 см. Не забудьте нанести контрольные точки — октопиновый или нопалиновый стандарт (Sigma).
5. Поместите бумагу в прибор для электрофореза с соответствующим буфером4^. Электрофорез ведите при напряженности поля 20 в/см, пока маркер не дойдет до края бумаги (примерно 1 ч при 400 В).
6. Высушите бумагу и окрасьте электрофореграмму фенантрехиноном5). Для визуализации пятен используйте длинноволновый УФ-свет. Всегда подвешивайте бумагу таким образом, чтобы шлейф аргининовых пятен был направлен в сторону (или вниз) от октопин-нопалиновых пятен. Это может оказаться полезным, если понадобится повторное окрашивание, на что укажет интенсивность аргининовых пятен. Эксперимент по определению OCS иллюстрирует рис. 11.
2) Буфер для экстракции готовится из раствора: 100 мМ трис-НС1 pH 8,0; 500 мМ сахароза; к этому раствору добавляют стерилизованные фильтрованием аскорбиновую кислоту и цистеин-HCl до концентрации 0,1%. Полный буфер хранят замороженным в виде 1 мл аликвот.
