Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
7. Растворите осадок РНК в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды и прогрейте раствор при 65° в течение 4 мин. Добавьте равный объем двукратного буфера для нанесения РНК и охладите препарат до комнатной температуры.
8. Медленно нанесите этот раствор на колонку с oli'go(dT) -целлюлозой. Промойте колонку 5—10 объемами буфера для нанесения, собирая фракции по 1 мл в микроцентрифужные пробирки, пока ОП2бо в этих фракциях не приблизится к нулю.
9. Промойте колонку 4 объемами буфера для промывки2).
10. Элюируйте ро1у(А)+мРНК пятью объемами колонки низкосолевого буфера для элюции3*, собирая фракции по 0,5 мл в стерильные микро-ценгрифужные пробирки. В каждой фракции измеряйте ОПгво, чтобы локализовать пик мРНК. Другой, более удобный способ элюции заключается в использовании перистальтического насоса и проточного регистрирующего спектрофотометра с малым объемом ячейки. Этот способ позволяет собирать непосредственно фракцию, содержащую элюируемый материал.
11. Объедините фракции, содержащие poly (А)+мРНК, в силиконированной пробирке Согех. Добавьте 1/10 объема ЗМ ацетата натрия (pH 5,2), два объема этанола и поместите на ночь в морозильную камеру на —20 °С.
12. Осадите РНК центрифугированием в бакет-роторе при 8000 g в течение 30 мин при 0°С. Осторожно удалите этанол и осадок промойте дважды 70%-ным этанолом.
13. Закройте пробирку парафилмом, затем пленку проколите в нескольких местах и подсушите РНК в вакууме в течение 5 мин. Растворите РНК в стерильной дистиллированной воде в концентрации 0,5 мг/мл, разделите на небольшие порции и храните при —70 °С. Можно также хранить мРНК в 70%-ном этаноле при —20 °С.
') Буфер для нанесения РНК: 20 мМ трис-НС1 pH 7,5; 0,5 М NaCl; 1 мМ ЭДТА; 0,05% SDS. Все компоненты, за исключением SDS, смешивают и автоклавируют. SDS готовят в виде 10%-ного (по весу) раствора и перед тем, как добавить в буфер, выдерживают в течение 1 ч.
2) Буфер для промывки имеет тот же состав, что и буфер для нанесения, но вместо 0,5 М NaCl содержит 0,1 М NaCl.
3) Низкосолевой буфер для элюции: 20 мМ трис-НС1 pH 7,5—1 мМ ЭДТА—-0,02% SDS.
Генетическая инженерия растений
щей системе [34]. Оценить эффективность трансляции РНК особенно важно, если в дальнейшем планируется использовать этот препарат для получения кДНК. Размер выделенной РНК можно оценить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии подходящих маркеров [34].
5. Изучение структурной организации и экспрессии чужеродной ДНК в растительной ткани
Осуществив трансформацию растительной ткани чужеродной ДНК с помощью того или иного метода, из описанных в разд. 3, можно приступать к изучению структурной организации и экспрессии этой ДНК в трансформированной ткани. Поскольку подобный анализ выходит за рамки частной задачи и соответствующие методы исследования, составляющие методическую базу молекулярной биологии в целом, подробно описаны в руководстве [15], мы ограничимся лишь их кратким обзором.
Для изучения структурной организации чужеродной ДНК, интегрированной в растительный геном, используют блот-гиб-ридизационный анализ ДНК, выделенной ускоренным методом (разд. 4.1). По результатам блот-гибридизационных экспериментов можно судить о числе копий интегрированных последовательностей ДНК, о характере распределения в геноме множественных вставок (тандемная или расеянная организация) и о стабильности интегрированной ДНК в поколении F1 трансформированных регенерированных растений. Следует, однако, следить за тем, чтобы растительная ДНК была выделена из стерильной ткани, так как загрязнение полученного препарата ДНК A. tumefaciens может привести к ошибкам в трактовке результатов.
Транскрипционную активность чужеродной ДНК можно оценить при помощи дот-гибридизационного анализа, используя для этой цели препараты poly(А)+мРНК, полученные по методике, описанной в разд. 4.3. Недавно этим методом удалось продемонстрировать индукцию транскрипции гибридного гена со светозависимого промотора гена ss Rubisco: было проведено сравнение препаратов ро1у(А)+РНК из ткани, выращенной на свету, и из ткани, выращенной в темноте [13]. Более детальное представление о характере транскрипции позволяет получить так называемый «Нозерн» (Nothern)-блот-гибридизационный анализ РНК. 5'- и З'-концы транскриптов чужеродных генов можно определить при помощи S 1-картирования; это, в частности, представляет интерес в плане идентификации промоторных областей с использованием делеционного мутагенеза.
Наиболее прямым подходом к изучению экспрессии чужеродных генов в трансформированных растительных тканях явля-
24*
.372
Глава 4
ется измерение активности ферментов, кодируемых данными генами. Соответствующий ферментный анализ включает оценку активности октопин- и нопалин-синтазы, а также активности продуктов генов cat и nptll. (В некоторых экспериментах благодаря использованию канамицина заранее осуществляется селекция в пользу экспрессии nptll.) Измерение активности ферментов позволяет оценить транскрипционную активность соответствующих генов, однако говорить о прямой корреляции здесь нельзя. В тех случаях, когда продукт изучаемого гена не обладает энзиматической активностью, его можно обнаружить с помощью так называемого «Вестерн» (Western)-блот-гибридизационного анализа или стандартных иммунологических методов, используя подходящие антитела.
