Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Дрожжевой экстракт (Difco) 5 г
NaCl 10 г
Среда NB
Питательный бульон (Difco) 8 г
Среда АВ
20-кратный 1-кратный
Раствор I
К2НРО4 60 г 3 г
NaH2P04 20 г 1 г
Раствор И
NH4CI 20 г 1 г
MgS04-7H20 6 г 0,3 г
КС1 3 г 0,15 г
СаС12 3 г 0,01 г
FeS04'7H20 50 мг 2,5 мг
20-кратные растворы I и II автоклавируют раздельно, смешивают необходимые количества, разбавляют до 1-кратной концентрации и вносят глюкозу до 0,5%.
Среда SM
К2НРО4 2,05 г
КН2Р04 1,45 г
MgS04-7H20 0,5 г
NaCl 0,15 г
СаС12 0,02 г
(NH4)2S04 3,0 г
Глюкоза 4,0 г
Жидкая среда SM для конъюгации Идентична SM, но дополнительно содержит
feS°4 0,001 г
MgS04 0,001 г
Среда SMNO (не содержит азотистых соединений)4)
К2НР04 10,25 г
КН2Р04 7,25 г
г
0,15 г
MgS04-7H20 0,50
NaCl
СаС12 0,02 г
Октопин (или нопалин) 0,10 г
Глюкоза 2,00 г
^аОН 0,014 г
ьромфеноловый синий 0,15 г
330
Глава 4
Продолжение
Маннитол-глутаматная среда (MG)
Маннитол Глутамат натрия КН2Р04 NaCl
MgS04-7H20
Биотин
10 г 2,32 г 0,5 г 0,2 г 0,2 г 2 г
Среда LBMG
Среду готовят, смешивая равные объемы LB и MG
Буфер для разведения фага X
Трис-НС1 pH 7,4
NaCl
MgCl2
10 мМ 100 мМ 10 мМ
>) Для приготовления агаризованной .среды SMNO необходимо предварительно промыть агар в бидистиллированной воде, чтобы удалить азотистые примеси. 15 г агара промывают в 1 л воды.
Е. coli НВ101 путем трансформации (в табл. 2 приведен список штаммов, используемых в описываемых методиках). Отсутствие других плазмид облегчает анализ трансформантов (см. разд. 2.1). Затем в этот же штамм НВ101 (pBR322::X) вводят плазмиды pGJ28 и R64drdll для того, чтобы в дальнейшем обеспечить конъюгативный перенос рекомбинантной конструкции в A. tumefaciens. Эту процедуру осуществляют путем конъюгации до-норного штамма GJ23 (содержащего pGJ28 и R64drd 11) и ре-ципиентного НВ101 (pBR322 :: X). Фенотип гесА штамма НВ101 препятствует гомологичной рекомбинации между pGJ28 и pBR322::X. Эксконъюгантов отбирают на чашках с LB-агаром в присутствии ампициллина, канамицина и стрептомицина. Концентрации антибиотиков в среде указаны в табл. 3. Эксконъюгантов, полученных в результате данного скрещивания, затем скрещивают с реципиентным штаммом A. tumefaciens GV31Q1 (pGV3850). Эксконъюгантов можно отбирать на чашках со средой АВ (табл. 1), обеспечивающей селекцию против донора и содержащей канамицин или любой другой антибиотик, устойчивость к которому кодируется конструкцией pBR322::X. Конъюгацию бактерий проводят по методике, описанной в табл. 4.
Альтернативный способ введения рекомбинантной конструкции в A. tumefaciens предусматривает триродительское скрещивание. Этот метод достаточно прост; он основан на том, что конъюгативный перенос R64drdll и pGJ28 из одного штамма Е. coli в другой происходит чрезвычайно эффективно (около 50% реципиентов приобретает эти плазмиды). Методика за-
2.2.1. Триродительские скрещивания
Генетическая инженерия растений
331
Таблица 2. Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм Характеристика Ссылк
Штаммы Е. coli
НВ101 F~, r~в, m~в, RecA, ara, proA, lacY, galK, str,
[15]
GJ23 RecA-мутант AB115; содержит pGJ28 и [18]
R64drdl 1
JM83 K12, несущий интегрированный в геном Ф 80 с
lacZ ДМ 15
{ага, Ыас-pro, strA, thi, <t>80dlacZ ДМ15) [38]
