Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Второй путь основан на использовании двух плазмид. Одна из них представляет собой вектор, способный реплицироваться в Е. coli и A. tumefaciens; вектор содержит граничные последовательности Т-ДНК, фланкирующие селективный маркер и сайт клонирования. Эту плазмиду вводят в клетки Agrobacterium, содержащие вспомогательную Ti-плазмиду (или плазмиду-помощник), которая имеет большую делецию, включающую Т-ДНК, но сохраняет область vir. Гранс-комплементация затем обеспечивает перенос ДНК, заключенной между граничными последовательностями векторной плазмиды, в ядерный геном растительной клетки.
Поскольку A. tumefaciens не способен инфицировать однодольные растения, например хлебные злаки, Ti-плазмиды нельзя использовать для их трансформации. Вот почему мы включили в обсуждение альтернативные методы трансформации этих растений. Недавно появилось сообщение о том, что лилия и нарцисс могут инфицироваться Ti-плазмидами; этот вывод был сделан на основании того факта, что в инфицированной растительной ткани экспрессируются опины [8]. Однако пока не удалось продемонстрировать устойчивое наследование чужеродных генов у этих растений. Поэтому представляется целесообразной разработка векторов для трансформации однодольных на базе вирусов растений. Подобные векторы были бы анало-
21—196
322
Глава 4
гичны векторам для трансформации животных на основе SV-40 и включали бы вирусную область начала репликации и селективный маркер.
2.1. Челночные векторы и акцепторные векторы на базе Ti-плазмид для переноса чужеродного генетического материала в растения
2.1.1. Опс~-векторы
Как уже говорилось во вводном разделе настоящей главы, эти векторные системы созданы на основе неонкогенных Ti-плазмид. Акцепторный вектор pGV3850 [9] представлен на рис. 2. Он сконструирован на базе Ti-плазмиды нопалинового типа pTiC58 и имеет следующие характерные черты.
1. Он содержит граничные последовательности Т-ДНК и целиком внешние прилежащие области Ti-плазмиды.
2. В состав этого вектора рядом с правой граничной последовательностью входит участок Т-ДНК, кодирующий фермент нопалин-синтазу; соответствующая энзиматическая активность служит маркером для идентификации трансформированных клеток.
3. Внутренние гены Т-ДНК, определяющие ее онкогенность и препятствующие нормальной дифференцировке трансформированных растительных клеток, удалены.
4. Эти делетированные внутренние участки Т-ДНК заменены последовательностью ДНК вектора для молекулярного клонирования pBR322.
Присутствие ДНК pBR322 в составе pGV3850 делает этот вектор универсальным акцепторным вектором: любой ген, клонированный в плазмиде pBR322 или ее производных (выполняющих роль челночного вектора), может быть легко вставлен между граничными последовательностями Т-ДНК за счет гомологичной рекомбинации с образованием плазмидного коинте-грата. Челночный вектор нетрудно передать из Е. coli в A. tumefaciens путем конъюгации (разд. 2.2). Поскольку pBR322 и ее производные не способны реплицироваться в клетках A. tumefaciens, отбор кроссоверов проводится по устойчивости к антибиотику, кодируемой соответствующим геном челночного вектора. В разд. 2.3 описан быстрый метод анализа природы' полученного коинтеграта.
Тип применяемого челночного вектора зависит от того, какой ген планируется ввести в растение. Созданные на сегодняшний день конструкции включают плазмиды семейства pBR322, в которые введен промотор гена нопалин-синтазы (nos), состыкованный с кодирующей областью одного из следующих генов: ocs (октопин-синтаза из Ti-плазмиды октопинового типа), nptU
Генетическая инженерия растений
323
Рис. 2. Использование Ti-плазмидного вектора pGV3850 для экспрессии в растительных клетках чужеродных генов. Сначала интересующий ген клонируют в векторе типа pBR322 в Е. coli. Эту плазмиду затем мобилизуют в Agrobacterium. Происходит коинтеграция рекомбинантной плазмиды, несущей интересующий ген,; в pGV3850. Зачерненным треугольником показан ген лекарственной устойчивости, отличный от гена устойчивости к карбенициллину. ДНК pBR322 (волнистая линия) в составе pGV3850 фланкирована Т-ДНК, содержащей левую и правую граничные последовательности и ген nos. (Воспроизводится с любезного разрешения авторов работы [9].)
(неомицин-фосфотрансфераза II, ген канамициновой устойчивости из транспозона Тп5), dh.fr (дигидрофолатредуктаза), гена устойчивости к метотрексату из плазмиды R67 и cat (хлорам-феникол-ацетилтрансфераза, ген устойчивости к хлорамфенико-лу, исходно выделенный из транспозона Тп9). Эти векторы содержат также последовательности ДНК из некодирующих З'-концевых областей nos- или ocs-генов, локализующиеся у З'-конца кодирующей зоны гибридного гена. Такие последовательности призваны обеспечить правильный сплайсинг и поли-
21*
324
Глава 4
аденилирование образующегося транскрипта [7, 10, 11—13]. Кодирующая область бактериального происхождения позволяет проводить селекцию трансформантов по устойчивости к антибиотику. Недавно Эррера-Эстрелья с сотр. [13] состыковали промотор ядерного гена малой субъединицы рибулозодифос-фат—карбоксилазы (ss Rubisco) гороха с кодирующей областью гена cat и продемонстрировали светоиндуцируемую экспрессию этого гена при введении его в Nicotiana tabacum.
