Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Электронейтральность. Число положительно и отрицательно заряженных ионов в данной зоне одинаково.
Химическое равновесие. Содержание диссоциированных и недиссоциированных молекул определяется константами кислотно-щелочного равновесия.
Основываясь на этих принципах, можно 'вывести несколько уравнений, позволяющих рассчитать системы для изотахофо-реза катионов [99], анионов [348] и белков [233, 646, 1116]. Более детальное описание метода читатель найдет в ряде прекрасных обзоров [347, 352, 353, 906, 1116].
При изотахофорезе разделение ионов происходит в соответствии с их подвижностями, а концентрация ионов в каждой зоне зависит от концентрации предшествующего иона. Это означает, что концентрация ионов в любой зоне определяется первым, или ведущим, ионом. Необходимо, чтобы исследуемый ион находился между ведущим и замыкающим ионами. Последний должен обладать самой низкой подвижностью по сравнению со всеми находящимися в системе ионами. В этом случае ионы располагаются в такой последовательности, что нон с более высокой подвижностью будет двигаться впереди иона с меньшей подвижностью. Поскольку в условиях изотахо-
Рис. 63. Изменение концентраций ионов в процессе изотахофореза.
фореза скорости всех ионов, как и сила тока во всех зонах, одинаковы, согласно закону Ома [уравнения (4) и (5)], градиент напряжения в каждой зоне будет иньгм. Чем меньше подвижность иона, тем больше перепад напряжения в этой зоне. Поэтому все ионы приобретают одинаковую скорость, несмотря на различия в их подвижностях (рте. 63).
Как уже отмечалось, концентрации ионов в зонах не могут отличаться от той, которая задана концентрацией ведущего иона и подвижностями ведущего и исследуемого ионов. Если же концентрация какого-либо иона, содержащегося в пробе, не подчиняется этому правилу, вытекающему из регулирующей функции Кольрауша, то он непременно подвергнется разведению или сконцентрируется до предписанного уровня (рис. 64). Вследствие этого изотахофореграмма отличается от всех других видов фореграмм и хроматограмм. На ней высота ступенек, образуемых сигналами, является характеристикой каждого вида иона, а расстояние между сигналами дает информацию о числе ионов.
При изотахофорезе наряду с эффектом концентрирования наблюдается также явление автоматического повышения резкости границ между зонами. Рассмотрим состояние равновесия, при котором все ионы движутся с одинаковой скоростью (ом. рис. 63), и предположим, что ион 0~ диффундировал в зону N~, где градиент напряжения ниже, чем в зоне О” При более низком градиенте напряжения скорость иона 0“ снизится и он не сможет двигаться наравне с другими ионами в зоне N" Поэтому он отстанет и снова попадет в свою зону. Если же ион О- диффундирует, наоборот, в зону R- с более высоким гради-
А
Время
Время
Рис. 64. Схематическое изображение концентраций ионов в условиях изотахо-
фореза.
ентом напряжения, то приобретет там более высокую скорость, благодаря которой этот ион опять-таки вернется в свою зону.
Для разделения с помощью изотахофореза двух ионов необходимо, чтобы их подвижности различались по крайней мере на 10% [99]. Подвижность иона зависит от нескольких параметров, например сольватации, вязкости растворителя, диэлектрической постоянной, наконец, радиуса и заряда иона [99]. Ее можно изменять, варьируя растворители или pH, определяющий соотношение между диссоциированными и недиссоцииро-ванными молекулами. Так, ионы К+ и NH+4 имеют в воде почти одинаковую подвижность, между тем они очень хорошо разделяются в метаноле [98]. Подвижность белкоя сильно зависит от pH, поэтому pH играет решающую роль при изотахофо-резе белков. Все зоны имеют разные величины pH. В анионной системе величина pH обычно возрастает в направлении от ведущего иона к замыкающему. При экстремальных значениях pH (ниже pH 3 и выше pH 10) условия изотахофореза нарушаются, так как ионы Н+ и ОН- сами обеспечивают проводимость. Присутствие карбоната при высоких pH также оказывает неблагоприятное действие [501, 1116]. Если в анионной системе величина pH более чем на 1 единицу ниже (а в катионной системе выше), чем величины р/С соответствующих видов ионов, то эффективная подвижность окажется настолько низкой, что возникает потребность в очень высоком градиенте напряжения, «который невозможно обеспечить доступными источниками питания. Степень варьирования pH ограничена также буферной емкостью противоиона [99].
ПРИБОРЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ ИЗОТАХОФОРЕЗЕ
Для получения воспроизводимых результатов очень важно выполнять следующие условия [353]. Изотахофорез следует проводить в трубке с совершенно одинаковым по всей ее длине внутренним диаметром, при постоянном составе 'ведущего электролита; необходимо соответствующим образом предотвратить появление электроэндосмоса и гидродинамического тока жидкости, а также обеспечить равномерное охлаждение трубки; буферная емкость ведущего электролита должна быть достаточно большой, чтобы препятствовать смещению зон pH в обратном направлении по сравнению с движением зон исследуемых веществ.
