Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 61. Схематическое изображение принципа непрерывного изоэлектрического фокусирования в гранулированной поддерживающей среде. А. Образец, содержащий три белка с различными изоэлектрическими точками, подается насосом через одну подводящую трубку. Б. Образец, содержащий три белка с различными изоэлектрическими точками, поступает по всем подводящим трубкам. В. Образец, содержащий только один белок, подается в кювету из трех трубок. В последнем случае белок должен сфокусироваться в одну струю; такой способ нанесения пробы удобен в процессе наладки прибора. 1 — электроды.
части размещены 54 выводные трубки. С помощью многоканального перистальтического насоса жидкость через эти трубки поступает в пробирки для собирания фракций.
Был описан другой способ проведения непрерывного ИЭФ в геле сефадекса [537]. Предложенный автором прибор сходен с описанным выше [365], но отличается от него рядом конструктивных особенностей. Его максимальная производительность составляет около 150 мг белка за 1 ч, что вполне достаточно также и для разделения амфолитов-носителей, если требуется выделить из них фракцию с узким интервалом значений pH.
Было проведено фракционирование амфолитов-носителей [432], полученных по методу Ригетти и др. [1095]. Рабочая кювета размером 14X22,5X0,6 см была изготовлена из плексигласа и заполнена сефадексом G-100. Снизу в нее вставляли 12 выводных трубок.
После проведения непрерывного проточного ИЭФ амфоли-ты-носители можно отделить с -помощью диализа и затем использовать повторно.
1.12.3. Трудности, связанные с разделением белков методом ИЭФ
После появления первых амфолитов-носителей были разработаны разнообразные методы ИЭФ, которые позволили без всяких осложнений разделить множество различных белков. В то
же время многочисленные данные, накопившиеся в литературе, указывают на то, что результаты опытов по ИЭФ следует оценивать с большой осторожностью из-за риска столкнуться с артефактами. Весьма возможным источником ошибок являются недостаточно чистые реактивы. Необходимо иметь в виду, что некоторые добавки к буферным растворам, например сахароза и другие вещества, применяемые для формирования градиентов плотности, а также мочевина используются в очень высоких концентрациях. Поэтому присутствующие в них примеси могут повлиять на поведение белков. Чтобы избавиться от таких эффектов, очевидно, следует применять высокоочищенные химические вещества.
Другая проблема, возникающая при ИЭФ, связана с образованием на аноде кислорода, который частично растворяется в среде и может окислять SH-груггпы белков. Чтобы предотвратить такое окисление, необходимо максимально сократить, насколько это допустимо, время проведения ИЭФ или добавить в среду восстанавливающие агенты, такие, как аскорбиновая кислота или тиоловые соединения [616].
Особое внимание при проведении ИЭФ нужно уделять белкам, неустойчивым в кислой или щелочной среде. В этих случаях рекомендуется вносить пробу в зону «безопасных» значений pH, избегать ее непосредственного контакта с электродными растворами, а после получения фракций, содержащих «pH-чувствительные» белки, как можно быстрее нейтрализовать их [1347].
Некоторые факты указывают на то, что выявляющаяся при ИЭФ неоднородность белкового препарата иногда обусловлена не его исходной молекулярной гетерогенностью, а использованным методом разделения. К появлению множественных полос приводит скорее всего взаимодействие белков с амфолита-ми-носителям'и. Фрейтер [398] показал, что некоторые белки шерсти дают целый ряд артефактов при ИЭФ в полиакриламидном геле. Аналогичные явления наблюдались при исследовании дрожжевой изоцитратдегидрогеназы [609], церулоплазмина [986], альбумина [659] и оксидазы L-аминокислот [1405].
Для решения вопроса о том, отражают ли обнаруженные при ИЭФ множественные полосы или зоны истинную гетерогенность белкового препарата или обусловлены взаимодействием белка с амфолитами-носителями, выделенные фракции следует подвергнуть повторному фокусированию при различных количественных соотношениях между амфолитами и белками.
В отдельных случаях можно также столкнуться с возникающими при ИЭФ специальными проблемами. Так, было обнаружено [549], что в процессе изоэлектрического фокусирования сульфированных гликопротеидов в кислой области градиента
pH происходит заметное осаждение белков на стеклянных стенках прибора. Чтобы воспрепятствовать такой адсорбции, внутреннюю поверхность аппарата покрывают слоем политетрафторэтилена.
Как свидетельствуют результаты огромного числа работ, несмотря на отмеченные выше трудности, ИЭФ является превосходным инструментом для разделения белков и других ам-фотерных макромолекул. Широкое разнообразие разработанных к настоящему времени методик позволяет выбрать наиболее подходящую из них для решения любых проблем в микроаналитической или аналитической области, а также в «препаративной работе с малыми или большими количествами материала. Создание новых амфолитов-носителей наряду с распространением недавно описанных типов приборов, вероятно, будет способствовать еще более широкому использованию ИЭФ.
