Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 4
Изоэлектрические точки комплексов железа, рекомендуемых в качестве маркеров pH [901]
Соединение Изоэлектри-
ческая точка
Трис (4-гидрокси-1,10-фенантролин) железо (II) 5,45
T рис (5-гидГрокси-1,10-фенантролин) железо (II) 7,15
Бис (4-гидрокси-1,10-фенантролин) 5-гидрокси-1,10-фенантро- 6,24
линжелезо(П)
Бис (5-гидрокси-1,10-фенантролин) 4-гидрокси-1,10-фенантро- 6,82
линжелезо(П)
той. Далее строили кривые градиента pH в гелях, нанося на график длину пути, пройденного красителем (расстояние от верхнего края геля до соответствующей проволочки), против его ИЭТ. Такая методика дает возможность не только определять pH простым способом, но и наблюдать за сужением зон во время ИЭФ. Особенно удобен для этого патентованный синий V. Зеленая полоса, соответствующая его ИЭТ, окружена синей и желтой зонами, сужающимися в процессе ИЭФ.
Было изучено поведение при ИЭФ некоторых комплексов железа с замещенными производными фенантролина [901]. Их ИЭТ приведены в табл. 4. Все эти вещества очень хорошо фокусируются в полиакриламидных гелях и поэтому могут быть рекомендованы в качестве маркеров pH.
ИЭФ В ГРАНУЛИРОВАННОЙ ПОДДЕРЖИВАЮЩЕЙ СРЕДЕ
Методы с применением тонких слоев гранулированных гелей как поддерживающей среды сохраняют все преимущества описанного выше ИЭФ в геле и, кроме того, обладают рядом других полезных качеств. Так, в гранулированных гелях не возникают артефакты, связанные с полимеризацией, а эффект молекулярного сита не влияет на процесс фокусирования. Поэтому в таких гелях удается легко разделять и белки с большой молекулярной массой. Есть примеры использования для тонкослойного ИЭФ сефадексов G-75 и G-200, а также биогеля Р 60 [288, 1051, 1052].
Методика проведения изоэлектрического фокусирования в тонком слое проста. Стеклянные пластинки требуемого размера покрывают подходящим гелем. Создан специальный аппарат для тонкослойного ИЭФ с эффективной системой охлаждения [288]. Покрытые гелем пластинки слегка подсушивают и помещают на металлическую термостатируемую коробку. Угольные электроды располагают с двух противоположных сторон геля и соединяют с ним с помощью полосок из ацетата целлю-
лозы, одна из которых пропитана 0,2 М серной кислотой, а другая — 0,4 М этилендиамином. При работе с пластинками длиной 20 см создают градиент напряжения 7—10 В/см в течение первых 4 ч и 15—30 В/ом в последующие 3—4 ч.
Метод применим и для препаративного 'разделения белков как в небольших количествах (100—200 мкг), так и в большом масштабе (вплоть до 1 г). В последнем случае используют блоки геля размерами 40X20X1 см. Пробу смешивают с сефа-дексом и выливают в канавку, сформированную в слое геля [1051, 1052]. По окончании фракционирования макромолекулы можно выделить из геля путем элюирования отдельных его участков.
Для обнаружения сфокусированных в тонком слое гранулированного геля макромолекул либо проводят сканирование геля гтри 280 нм, либо получают реплику на бумаге [1051, 1052]. Для этого на поверхность геля накладывают лист фильтровальной бумаги, а через некоторое время, достаточное для диффузии определимого количества белка в бумагу, его снимают, высушивают и окрашивают.
При окрашивании белков амидовым черным 10 В или кумасси ярким синим R-250 и G-250, растворенными в смеси метанол— вода — уксусная кислота (50:50:10, по объему), необходимо предварительно удалить амфолин. Если белки окрашивают такими красителями, как бромфеноловый синий, кумасси фиолетовый R-150 и световой зеленый SF, то можно работать в присутствии амфолина, но при этом следует использовать низкие концентрации красителей (не выше 0,1—0,2%), так как при более высоких концентрациях они .способны образовывать нерастворимые комплексы с амфолином. Например, световой зеленый в концентрации 0,5—1% окрашивает не только белки, но и амфолиты-носители. Радола [1051] подобрал условия, в которых наибольшей чувствительностью по отношению к белкам обладали кумасси яркий синий G-250 и R-250.
Методы непрерывного ИЭФ в гранулированной поддерживающей среде. Принцип метода схематически изображен на рис. 61. Прибор для проведения непрерывного фокусирования в сефадексе G-100 [365] имеет разделительную ячейку, изготовленную из двух пластин размерами 23X30 см, укрепленных на расстоянии 3 мм друг от друга. Пространство между ними заполняют сефадексом G-100, уравновешенным против амфолина с выбранным диапазоном pH. Боковые поверхности слоя геля отделяют от электродных растворов мембранами. Для их изготовления используют пористую полиэтиленовую пленку, поры которой заполняют гелеобразующим раствором акриламида. Электроды делают из платиновой проволоки. Исследуемый раствор и амфолин подают в верхнюю часть кюветы. В ее нижней
А Б В
