Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Колин получил градиенты pH, наслаивая друг на друга буферные растворы с разными значениями pH [699—702]. Свен-ссон [1259] назвал такую систему «искусственным (artificial) градиентом pH». Она не устойчива во времени вследствие
электрофоретического движения буферных ионов. Позднее Колин [703] суммировал условия, необходимые для четкого фокусирования белков в градиентах pH, стабилизированных против конвекци'и с помощью градиента плотности сахарозы. Он понял, что для получения однородной напряженности поля следует применять электролиты, обладающие хорошей проводимостью, и что использование градиентов с высокой буферной емкостью имеет большое значение.
Основываясь на этих предварительных данных, Свенссон в серии работ [1260—1262] определил условия получения устойчивых градиентов pH. Он ввел термин «естественный (natural) градиент pH», который можно пояснить на следующем примере. Предположим, что разбавленный раствор нейтральной соли, например сульфата натрия, подвергается электролизу между платиновыми электродами. При отсутствии .перемешивания у катода и анода будут накапливаться соответственно гидроксид натрия и серная кислота. Если теперь добавить в систему амфотерное вещество, то оно окажется отрицательно заряженным у катода и положительно заряженным у анода. Так как отрицательно заряженные ионы должны двигаться по .направлению к аноду, а положительно заряженные — к катоду, ионы амфотерного вещества, добавленного в систему, переместятся от электродов и займут какое-то промежуточное положение между ними в том месте, где pH среды окажется равным их изоэлектрической точке. При этом суммарный заряд амфотер-ных молекул станет равным нулю. Если же в описанную выше систему ввести смесь амфотерных веществ, то каждое из них достигнет места, соответствующего его изоэлектрической точке. Компоненты с высокими изоэлектрическими точками будут фокусироваться вблизи гидроксида натрия, а с низкими — вблизи серной кислоты. Это означает, что между анодом и катодом’ сформировался градиент pH. В тех случаях, когда нет необходимости в предельно высоких и низких значениях pH, можно использовать соль более слабого основания и более слабой кислоты, например ацетат аммония. Для создания стабильного градиента pH между pH 3 и 4 пригодна смесь пиколиновой, глутаминовой, никотиновой, аптраниловой и л^аминобензойной кислот [1260]. Градиенты pH, образованные описанным способом, были названы естественными, потому что они созданы и стабилизированы электрическим током. Свенссон [1260] отметил также, что любой искусственный градиент pH превратится в естественный, если проводить электролиз достаточна долго.
Для того чтобы с помощью стационарного электролиза разделить два амфолита, необходимо присутствие третьего с промежуточной изоэлектрической точкой [1260]. Его роль мо-
жет выполнять растворитель, Вестерберг и Свенссон [1348] попытались использовать в качестве амфолита-носителя гидролизат гемоглобина, но обнаружили, что полученная при гидролизе смесь пептидов не удовлетворяет полностью предъявляемым требованиям. Тогда они испытали набор синтетических алифатических аминокарбоновых кислот, и в результате им удалось разделить белки, различающиеся по изоэлектрическим точкам лишь на 0,02 единицы pH. Это отюрытие наряду с теоретическими исследованиями и промышленньим производством амфолитов-носителей сделало возможным применение различных методик ИЭФ для разделения белков, •полипептидов и нуклеиновых кислот.
Хотя ИЭФ является сравнительно новьгм методом, ему посвящен уже целый ряд обзоров [208, 500, 502, 1093, 1096, 1097, 1340, 1344, 1345, 1347, 1429, 1458].
1.12.1. Формирование градиентов pH
Градиенты pH можно получать тремя принципиально разными методами:
1) с помощью амфолитов-носителей,
2) путем формирования температурного градиента и
3) посредством вспомогательного градиента концентрации.
Все эти методы будут кратко рассмотрены ниже.
АМФОЛИТЫ-НОСИТЕЛИ
Исходя из теоретических соображений Свенссон и Вестерберг [1260—1262, 1348] пришли к заключению, что амфотерные соединения, используемые в качестве амфолитов-носителей при разделении белков методом ИЭФ, должны отвечать следующим требованиям (см. обзоры [1344, 1345, 1347]):
1. Амфолиты-носители должны обладать высокой буферной емкостью при значениях pH, близких к их изоэлектрическим точкам, чтобы величина pH не изменялась даже в присутствии 0,5% белка при том, что средняя концентрация самих амфолитов-носителей составляет 1%.
2. Для достижения хорошего разделения веществ, лишь слегка различающихся по изоэлектрическим точкам, необходимо использовать большое число амфотерных соединений, изо-электричеокие точки которых различаются менее чем на 0,05 единицы pH.
3. Существенно, чтобы иэоэлектрические точки амфолитов-носителей охватывали широкий диапазон pH, желательно от
2,5 до 11, так как ИЭТ большинства белков лежат в пределах нежду pH 3 и 10.
_СН2 — N — (CH2)n— N— СНг —
(CH2)n R
NR2
