Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Рис, 44. Микроэлектрофорез в капиллярной трубке [914]. 1 — электрод из платиновой проволоки; 2 — стеклянная воронка; 3— электродный буфер, рн 8,4; 4 — резиновый колпа-
чок; 5 — буфер концентрирующего геля, pH 6,7; 6 — раствор белка (0,1 — 1 мкл); 7 — 5%-ный концентрирующий гель, pH 6,7; 5 —25%-ный разделяющий гель, pH 8,8.
ке [602], которые будут служить верхним электродным сосудом, тогда как нижним может быть небольшая чашка Петри или маленький стаканчик объемом 5 мл. Во избежание (высыхания гелей оба электродных сосуда сразу же заполняют соответствующим буфером, в который погружают в качестве электродов платиновую проволоку. Предпочтительно, чтобы источник питания поддерживал постоянным напряжение, а не ток [918]. Как правило, для более концентрированных гелей требуются более высокие градиенты напряжения. В 20%-ном полиакриламидном геле белковые компоненты лучше всего фракционируются при общем падении напряжения 60—80 В. Поскольку размеры капилляров малы, охлаждать их в ходе опыта не обязательно. Электрофорез прекращают, когда маркирующий краситель проходит нужное расстояние (20—30 мин).
После окончания электрофореза гели выталкивают при помощи шприца на 2 мл с навинчивающейся конической насадкой, на которую надета трубочка с внутренним диаметром 1 мм. Капилляр присоединяют к кончику этой трубочки и, осторожно нажимая на шприц, извлекают гель. Можно также выдавить гель куском проволоки, плотно входящей внутрь капилляра [602]. Гели окрашивают в течение примерно 5 мин, затем отмывают от избытка красителя (около 30 мин) и хранят в соответствующем растворе, как обычно.
Микрогели удобно фотографировать в стеклянном лотке, заполненном 7,5%-оюй уксусной кислотой, или денситометри-ровать в специальной стеклянной камере [915]. Для определения белков применяется также метод интерферометрии [602].
Электрофорез в капиллярах, заполненных градиентным гелем. Для приготовления градиентных гелей в капиллярах было предложено [1196] погружать их в раствор с предварительно сформированным градиентом концентрации акриламида (5—25%). Скорость погружения капилляра регулировали, используя специальный держатель, связанный через эксцентрик с электромотором. Чтобы избавиться от капиллярного эффекта и получить требуемый градиент, капилляры сначала снизу наполняли буфером для геля, содержавшим 0,2% тритона Х-100, и лишь затем постепенно погружали в градиентный раствор. Предварительно их устанавливали вертикально в прикрепленную к стальному стержню полиэтиленовую трубку с нижним отверстием, затянутым нейлоновой сеткой. В конце заполнения в систему добавляли 50%-ную сахарозу, которая вытесняла раствор акриламида в капилляры и препятствовала его полимеризации на нейлоновой сетке [915].
Весьма простой и воспроизводимый метод получения градиентных микрогелей разработал Нейхофф [915]. В капилляр до
половины его высоты набирают за счет капиллярных сил 2%-ный раствор тритона X-100, содержащий персульфат аммония в концентрации 0,7 мг/мл, а затем его заполняют доверху смесью акриламида, быс-акриламида, ТЕМЭД «и феррицианида калия (0,8 мг/мл) в соответствующем буфере. Градиент концентрации формируется благодаря диффузии веществ примерно через 15 м'ин. В течение этого времени феррицианид калия задерживает полимеризацию геля. Заполненные капилляры устанавливают вертикально либо на подушку из пластилина, либо в 50%-ный раствор сахарозы глубиной 2—4 мм. В последнем случае силы адгезии между сахарозой и стеклянными стенками капилляра прочно удерживают капилляр в вертикальном положении. Предварительно необходимо убедиться в том, что капилляр действительно целиком заполнен раствором, так как в противном случае в него может проникнуть сахароза, которая препятствует образованию равномерного градиента. Применение сахарозы позволяет обходиться без пластилина и получать гели одновременно в 10—20 капиллярах, соединенных вместе кусочком липкой ленты. Полимеризация развивается сверху вниз, так как именно в этом направлении возрастает концентрация феррицианида калия. Над образовавшимся гелем обычно находится слой водного раствора толщиной 10—12 мм, который обеспечивает получение ровной поверхности геля. После его удаления в капилляре остается достаточное пространство для внесения 'в него исследуемой пробы. Самая высокая концентрация геля наблюдается на высоте 5—6 мм. Это позволяет выталкивать гель проволокой, плотно входящей в отверстие капилляра.
Длину и крутизну градиента регулируют несколькими способами. Так, при добавлении сахарозы в первый раствор градиент становится менее крутым, а увеличение диаметра капилляров приводит к образованию более коротких и крутых градиентов. Наконец, варьируя концентрацию раствора акриламида, можно создать градиент, подходящий для разделения любой смеси веществ.
Процедура приготовления градиентных микрогелей упрощается еще в большей степени, если и пробу вносят в капилляр, используя силы поверхностного натяжения. При этом вначале засасывают раствор акриламида с высотой плотностью, затем последовательно вводят персульфат аммония, буферный раствор, содержащий 20% сахарозы, и, наконец, разбавленную пробу. После этого капилляр немедленно переворачивают и оставляют в вертикальном положении во влажной камере для полимеризации.
