Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
R может быть:
(СН2)П—СООИ, Н, (CH2)n— ISI — R
R
п < 5
Рис. 50. Общая формула амфолитов-носителей, выпускаемых фирмой LKB-Producter АВ (Стокгольм, Швеция) под торговым названием «амфолины*
«Ampholine»).
4. Амфолиты-носители должны иметь высокую раствори-мость в воде.
5. Необходимо, чтобы амфолиты-носители обладали доста-точно низкой оптической плотностью при 280 нм, так как измерение поглощения ультрафиолетового света служит наиболее простым способом выявления белков.
6. Амфолиты-носители не должны прочно связываться с белками. С этой точки зрения гидрофильные вещества имеют преимущество перед гидрофобными, так как последние сильнее «¦прилипают» к белкам.
7. В конце опытов по препаративному выделению макромолекул амфолиты-носители необходимо удалить из раствора. Поэтому лучше использовать амфолиты с низкой молекулярной массой, поскольку их можно затем легко отделить от макромолекул.
8. Очень важно, чтобы в процессе электрофокусирования проводимость была везде равномерно высокой, так как в зонах с пониженной проводимостью может возникнуть местный перегрев.
Первыми амфолитами-'носителями, удовлетворявшими сформулированным выше требованиям, были соединения, синтезированные по методу Вестерберга [1341]. Этот метод основан на том, что в водном растворе при взаимодействии акриловой кислоты с различными полиэтиленполиаминами образуется ряд гомологичных и изомерных полиаминополикарбоновых кислот с молекулярной массой преимущественно ниже 1000. Их общая формула представлена на рис. 50. Продукты этих химических реакций можно разделить с помощью ИЭФ, чтобы
NH
11
Н2 N — С -NH — СН2— N — СН2— СН2— СН2—N — СН^— СН2™ NH
сн2
I *
соон
I
NH
I
Рис. 51, Предполагаемая типичная формула амфолитов-носителей, выпускаемых фирмой Serva Fembiochimica (Гейдельберг, ФРГ) под торговым названием «сервалит» («Servalyt»). (Из каталога фирмы за 1975 г.)
получить амфолиты-носители с более узким интервалом pH. Амфолиты-носители такого типа были первым препаратом, выпущенным в продажу фирмой LKB (Швеция) под названием амфолпн. В настоящее время продаются уже готовые к употреблению смеси, охватывающие весь диапазон pH или отдельные узкие его области (см. рис. 52).
Петтерссон [1001] предложил метод создания градиентов pH в узкой зоне между pH 1 и 3 путем смешивания дихлорук-сусной, фосфорной, хлоруксусной, лимонной, муравьиной и уксусной кислот.
Описаны способы приготовления и стабилизации градиентов pH в интервале pH 3—9,5 с помощью соединений, образующихся при сополимеризации акриловой кислоты и пентаэтилентетр-амина [1355], а также при реакции акриловой кислоты с гекса-метнлентетрами'ном, триэтмлентетрамином, тетраметиленпент-лмином или пентаэгиленгексамином [1095].
Продукты реакции, полученные в результате взаимодействия тетраметиленпентамина и пентаэтиленгексамина с пропан-сульфоном, вннилсульфонатом или хлорметилфосфонатом служат амфолитами-носителями в диапазонах pH 2—3,5 и 5,8—
Новый тип амфолитов-носителей разработан и недавно выпущен в продажу фирмой Serva (Гейдельберг, ФРГ) под торговым названием сервалит (Serva, Feinbiochemica Catalog, 1975, с. 189). Предполагаемая формула его компонентов приведена на рис. 51. Они образуются в ходе реакции, в которую вступает смесь пропанеульфона, хлорметилфосфоновой и акри-
9,5 [956].
—2 —3 — 4—5—б—7—5—9—Ю —11—11—pH
5*
§
«о
QJ
О
Рис. 52. Границы pH имеющихся в продаже смесе,й амфолитов-носителей (ам-
фолинов и сервалитов).
ловой кислот с несколькими сильно разветвленными полиаминами, содержащими в среднем на молекулу по 5—6 атомов азота и по 2—3 метиленовые группы между соседними атомами азота, а также с некоторыми их производными, имеющими в своем составе гуанидиновые группы. Синтезированные соединения с аминогруппами имеют .величины рК от 10 до 4, а для соединений с гуанидиновыми группами характерны еще более высокие значения р/С. Таким образом, изменяя состав исходных реагентов, можно получить смесь амфотерных веществ с изо-электрическим-и точками, лежащими между pH 2 и 11. Подобно амфолину, сервалит пригоден для фракционирования как в широких, так и в узких пределах pH (рис. 52).
Особенно часто применяются и детально исследованы амфо-литы-носители фирмы LK.B (Швеция). Можно предположить, что основные выводы, полученные при изучении амфолина фирмы LKB, справедливы и для других типов амфолитов-носите-лей, если они удовлетворяют предъявляемым к ним требованиям.
