Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
При работе с клеточными 'культурами нужно строго соблюдать все меры предосторожности, чтобы избежать попадания инфекции. Если нет специальной комнаты для работы с культурами, то сначала лучше провести все операции с клетками, а потом уже приступить к работе с вирусами. Стол должен быть чистым и свободным от оборудования, которое не требуется для манипуляций с клеточными культурами. Горлышки пробирок, флаконов и матрасов нужно обжечь пламенем перед тем, как открыть и закрыть их. Пробки следует брать пинцетом. Эти элементарные меры предосторожности часто не соблюдают, если в культуральной среде содержатся антибиотики и антигрибковые препараты. Следует помнить, что антибиотики подавляют бактериальный рост, но они не абсолютно надежны, а если в культуры попала инфекция, то избавиться от нее чрезвычайно трудно.
ХРАНЕНИЕ В ЖИДКОМ АЗОТЕ
Заражение клеточных культур происходит порой даже при очень хорошо организованной ряботе с ними. Восполнить погибшие по тем или иным причинам куль-
туры можно за счет запаса клеток, хранящихся в жидком азоте. На рис. 4.2 показан аппарат для хранения большого числа ампул, которые погружают в жидкий азот. В более поздних моделях контейнеры с клетками хранятся в газовой фазе, а не погружены в жидкость. Это усовершенствование позволяет хранить клетки в маленьких бутылочках (7 см3) с завинчивающимися пробками.
Методика хранения клеток в замороженном виде в основном одинакова для всех клеточных линий. Для этой цели отбираются молодые культуры, находящиеся в хорошем состоянии. Клетки снимают со стекла обычным методом и концентрируют до 1 ООО ООО клеток в 1 мл; желательно 'получать даже более концентрированные суспензии. Среда, в которой хранятся клетки, состоит из обычной ростовой среды и консерванта, например 10—15%-ного забу-ференного глицерина или
диметилсульфоксида. Суспензию клеток помещают в стеклянные ампулы, которые тщательно запаивают. Следует обращать особое внимание, чтобы не переполнять ампулы. Содержимое замораживают, каждую минуту снижая температуру на 1 °С. Замораживание продолжают до тех пор, пока температура не упадет от +4 до —50 °С или ниже. Более быстрое и более медленное охлаждение вызывает образование кристаллов льда, в результате чего клетки утрачивают жизнеспособность. Сейчас выпускаются специальные аппараты, в которых осуществляется контроль процесса замораживания. За-
Рис. 4.2. Контейнео с жидким азотом.
Показаны канистра и штатив, в котором хранятся ампулы.
мороженные ампулы помещают в обоймы и опускают ниже поверхности азота.
Для того чтобы клетки возобновили рост, ампулы с клетками переносят из жидкого азота в водяную баню при 37 °С. Когда жидкость растает, суспензию клеток отсасывают из ампулы, промывают свежей ростовой средой, чтобы удалить консервант, и помещают во флаконы или пробирки для культивирования.
Работа с жидким азотом требует защитной одежды, особенно защитных очков для глаз. В ампулы, плохо запаянные или с трещинами, попадает азот. Когда такие поврежденные ампулы вынимают из хранилища, жидкий азот в них быстро испаряется, в результате чего ампула может взорваться. При попадании жидкого азота на кожу иногда возникают тяжелые долго не заживающие «ожоги». Намного безопаснее хранить клетки не в стеклянных, а в пластиковых ампулах с завинчивающимися пробками.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
Чрезвычайно важно, чтобы пробы для выделения вируса были взяты правильно и как можно быстрее доставлены в лабораторию. Если пробы собраны плохо, то выделение вируса затрудняется,
СРЕДА ДЛЯ ПЕРЕНОСА ВИРУСНОГО МАТЕРИАЛА
Мазки собирают в среду, состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков, необходимых для предотвращения роста бактерий и плесневых грибов, и небольшого количества (0,5%) белка, например бычьего альбумина, добавляемого для стабилизации имеющихся вирусов. Кончик тампона, которым брали мазок, отламывают и помещают в бутылочку с 2—3 мл такой среды. Содержимым бутылочек заражают клеточные культуры, стараясь при этом, насколько возможно, сократить время между взятием пробы и заражением культур. В эту среду можно собирать также кусочки тканей для вирусологического исследования.
Мочу для выделения цитомегаловирусов собирают в среду, содержащую не менее 50% сорбитола. Мочу для выделения других вирусов можно транспортировать, не добавляя среду. Пробы фекалий собирают в картонные вощеные коробочки без какой-либо среды. Перед инокуляцией pH в пробах мочи и суспензии фекалий доводят до 7,0.
Пробы следует доставлять в лабораторию как можно быстрее. Если для доставки пробы требуется не более 48 ч, то после сбора их лучше хранить при 4°С и доставлять упакованными в тающий лед. Если срок доставки превышает 48 ч, то пробы нужно быстро заморозить в смеси сухого льда и спирта и транспортировать в контейнере с сухим льдом.
После того как пробы доставят в лабораторию, необходимо решить, какие культуры инокулировать. Каждая проба должна сопровождаться четким и сжатым описанием клинической картины, с тем чтобы у сотрудников лаборатории сложились некоторые представления о природе инфекции.
