Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 4.1.
А. Нормальная культура клеток обезьяньей почки. Б, Пенящий агент в клет
ках обезьяньей почки.
обезьяний вирус 40, вызывающий спонтанную дегенерацию и являющийся онкогенным, и так называемый пенящий агент, вызывающий образование обширного ва-куолизированного синцития (рис. 4.1). Развитие цито-патических эффектов, обусловленных наличием этих вирусов, можно замедлить, ежедневно меняя среду. Од-
нако лучший способ избавиться от контаминантов — это брать в работу только клетки, свободные от вирусов.
В клетках обезьяны найдены некоторые опасные вирусы и среди них наиболее известен обезьяний вирус герпеса (вирус В). Этот вирус вызывает изъязвление ротовой полости у обезьян. У человека он вызывает тяжелый энцефаломиелит. В 1968 г. в Германии был выделен возбудитель другой тяжелой болезни человека — гепатита,— которая в некоторых случаях кончалась летальным исходом. Этот ©ирус вновь был выделен из клеток обезьян. Считают, что он принадлежит к пока еще неизвестной группе вирусов. Поэтому крайне важно, чтобы любой из работников вирусологической лаборатории немедленно обращался к врачу не только при укусах и царапинах, 'нанесенных обезьяной, но также и в случае, если он поранил себе руки, работая с клеточными культурами.
HELA И ДРУГИЕ ПЕРЕВИВАЕМЫЕ ЛИНИИ КЛЕТОК
Культура клеток HeLa была получена из карциномы шейки матки в 1952 г. [18]. Это злокачественные клетки, характеризующиеся различным кариотипом и сходные по своей морфологии с клетками плоского эпителия. В работе используют также клетки линий НЕр2 [19] и КВ [20]. Клетки этих линий легко культивировать, и они чувствительны ко многим вирусам. В основном их используют для выделения и идентификации аденовирусов, вируса герпеса простого и респираторного синцитиального вируса.
Для вирусологических исследований клетки HeLa обычно культивируют в матрасах, где они образуют монослой. Два раза в неделю клетки пересевают, для чего их снимают со стекла либо 0,02%-ным версеном, либо 0,25%-ным трипсином, суспендируют в ростовой среде и подсчитывают. Полученную клеточную суспензию разбавляют ростовой средой так, чтобы в 1 мл содержалось 100 ООО клеток. При такой посевной дозе клетками, содержащимися в одном матрасе объемом 100 см3, можно засеять 60 пробирок. Если опыт предполагается ставить вскоре после пересева, то можно засевать пробирки
из расчета 500 000 клеток на 1 мл. Посевная доза при пересевах для поддержания штамма составляет 100 000 клеток на 1 мл.
Ростовая среда для культивирования этих клеток состоит из смеси минимальной среды Игла и 10% телячьей сыворотки, pH 7,0. В качестве поддерживающей среды для сформированного монослоя используют минимальную среду Игла с добавлением 2% телячьей или эмбриональной телячьей сыворотки, pH 7,4.
Клетки, на которых выращивают респираторный синцитиальный вирус, культивируют в особых условиях. Для получения этого вируса обычно используют клетки HeLa штамма Бристоль. Их культивируют на среде с добавлением 'кроличьей сыворотки. В лаборатории автора респираторный синцитиальный вирус получают на клетках НЕр2, которые выращивают на среде с эмбриональной телячьей сывороткой. Выбранную клеточную систему необходимо время от времени проверять на чувствительность к этому вирусу. Клетки HeLa хорошо сохраняют жизнеспособность при хранении в жидком азоте.
Большинство постоянных клеточных линий заражено микоплазмами. Эти организмы обычно размножаются медленно и поэтому не препятствуют росту вируса. Однако при увеличении скорости их размножения в культурах накапливаются продуцируемые ими кислые продукты, которые оказывают токсическое действие на клетки. В такие культуры можно добавлять антибиотики, например тетрациклин. Но лучше всего браковать зараженные культуры и заменять их новыми из запасных культур. Заражение клеток бактериями, грибами и вирусами наблюдается редко, если при работе соблюдаются все меры предосторожности.
ФИБРОБЛАСТЫ
Культуры фибробластов получают из разных источников, в том числе из куриных эмбрионов и эмбрионов человека. Клетки имеют веретеновидную форму и растут, образуя плотно расположенные завитки, так что рисунок монослоя напоминает отпечаток пальца. Морфология монослоя этих клеток очень характерна.
Чаще всего культуры фибробластов получают из легких эмбриона человека (HEL); другой источник их получения— кожно-мышечный лоскут. Наиболее известен штамм фибробластов № 38 Вистарского института
(WI-38). Эти клетки чувствительны ко многим вирусам, в том числе энтеровирусам, всем вирусам группы герпеса и к большинству риновирусов. Главный недостаток этих клеток заключается в том, что они плохо растут на многих вариантах среды Игла, а также бывают чувствительны к некоторым партиям телячьей сыворотки. Удобнее получить собственную лабораторную линию этих клеток из свежих легких.
Для получения культуры легочных клеток лучше всего использовать эмбрионы в возрасте 14—18 недель; практически же приходится пользоваться любым имеющимся материалом. Легкие освобождают от фиброзной ткани, оставшуюся мягкую бледноокрашенную ткань разрезают на кусочки размером около 1 мм3. Кусочки отмывают от крови и суспендируют >в 0,25%-ном растворе трипсина. Суспензию инкубируют в течение 30 мин при 37 °С, после чего надосадочную жидкость удаляют. Оставшуюся ткань трижды обрабатывают трипсином по 30 мин каждый раз и собирают надосадочную жидкость после каждой обработки. Суспендированные клетки отделяют от трипсина центрифугированием при низких скоростях. Осадок клеток ресуспендируют в ростовой среде, объем которой примерно в 70 раз превышает объем клеток, и разливают в культуральные сосуды.
