Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Характерный монослой образуется через 48—72 ч после посева. Первые три дня среду нужно менять через каждые 24 ч для удаления разрушенных клеток. После образования монослоя клетки можно снять со стекла 0,25%-ным трипсином и пересеять в новые сосуды, так же как это было описано для клеток HeLa. В качестве ростовой и поддерживающей сред используются такие же среды, как и для клеток HeLa.
Получив новую линию, необходимо испытать ее в отношении вирусов, которые предполагается на ней выращивать, причем в тех же условиях. Параллельно с новой линией используют линию клеток, чувствительность которой известна. Если количество вируса и скорость
его роста одинаковы для обеих линий, то новые клетки пригодны для работы.
Линии фибробластов часто бывают полупостоянны-ми, т. е. их можно пересевать, но ограниченное число раз. Число пересевов колеблется от 30 до 50. Чтобы сохранить линию в лаборатории, необходимо законсервировать как можно больше клеток первых пересевов. Эти клетки обычно хорошо сохраняют жизнеспособность при хранении.
Фибробласты пересевают так же, как и клетки HeLa. Подсчитывают число клеток в суспензии и засевают в пробирки или матрасы из расчета 300 000 клеток на
1 мл. При такой дозе посева клетками из одного матраса объемом 100 мл3 можно засеять около 30 пробирок. Сплошной монослой получают через 3—4 дня. Культуры, в которых поддерживающую среду меняют по крайней мере два раза в неделю, хорошо сохраняются до 8 нед.
Фибробласты используют главным образо!М для выделения и идентификации вирусов группы герпеса, особенно таких «капризных» представителей этой группы, как вирусов ветряной оспы и опоясывающего лишая и цитомегаловируса. Цитомегаловирусы человека можно выделить только с помощью фибробластов человеческого происхождения. Изучение этого вируса приобретает все большее значение, поскольку с ним связаны внутриутробная инфекция, посттрансфузионный синдром и болезни типа инфекционного мононуклеоза. По этой причине в диагностической лаборатории нужно иметь линию фибробластов. С помощью фибробластов легко выделить кишечные вирусы, в частности вирусы группы ECHO. На некоторых линиях хорошо размножаются риновирусы штамма Н.
В культурах фибробластов встречаются латентные вирусы. Исследователи, которые работают с такими культурами, должны проверять свои линии на присутствие в них вируса краснухи. Заражение краснухой на ранних сроках беременности приводит в 30% случаев к внутриутробной инфекции плода, что нередко вызывает тяжелые врожденные уродства. Присутствие вируса краснухи на ранних сроках беременности является
достаточным основанием для ее прерывания. Ткани таких эмбрионов могут быть сильно инфицированы вирусом краснухи. _
КУЛЬТУРА АМНИОНА ЧЕЛОВЕКА
Эти клетки получают из плаценты, взятой при кеса* ревом сечении. Амнион отделяют от плаценты и отмывают от крови. Промытую ткань разрезают на небольшие кусочки и обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина. Полученную суспензию отмывают от трипсина, подсчитывают число клеток и засевают в пробирки из расчета по 500 000 клеток на 1 мл. Монослои эпителиальных клеток образуется через 4—7 дней. Эти клетки пригодны для выделения энтеровирусов, особенно вируса полиомиелита и ветряной оспы. Однако и здесь имеются свои недостатки. Во-первых, неприятна сама процедура получения клеток, так как приходится иметь дело с довольно грязным материалом. Во-вторых, нельзя точно знать сроки получения плаценты. И наконец, в-третьих, не всегда получаются успешные культуры.
Отметим также, что до сих пор неизвестны вирусы, которые размножались бы только в культуре амииоти-ческих клеток и не размножались бы в культурах описанных выше тканей, значительно более удобных для работы.
РАБОТА С КЛЕТОЧНЫМИ КУЛЬТУРАМИ
Для диагностической вирусологической лаборатории постоянно требуются клеточные культуры в хорошем состоянии, причем обычно опыт на культурах продолжается не менее 14 дней. Как правило, культуры готовят к работе раз в неделю. Быстро размножающиеся клетки, такие, например, как клетки HeLa, пересевают дважды в неделю. Как показывает опыт, запас культур в пробирках для недельной работы должен превышать истинную потребность. Кроме того, для бесперебойной работы лаборатории необходимо следить, чтобы всегда в достаточном количестве имелись запасные культуры.
Еженедельно необходимо возобновлять по 1 партии
клеток почки обезьяны и фибробластов и по 2 партии клеток НЕр2. Большое количество клеток почки обезьян инокулируется по двум причинам. Во-первых, процесс выделения энтеровируса требует большого числа пробирок для идентификации его с помощью нейтрализации. Во-вторых, если культура вдруг случайно прольется, то не всегда бывает удобно тотчас же удалять почку у обезьяны и, следовательно, невозможно получить запас вторичных клеток. Брать для этой цели клетки из основного запаса довольно расточительно. Поэтому считается более экономичным выбрасывать 100 неиспользованных пробирок каждую неделю, чем иметь недостаток культур в случае крайней необходимости. При нехватке клеток некоторые образцы замораживают, пока не появится возможность получить новые культуры. Следует отметить, что при замораживании некоторая часть вирусов, находящихся в образце, может инактивироваться.
