Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Элюирование осуществляется тремя способами: в простейшем варианте один растворитель постоянно пропускается через колонку. Это обычный метод в случае ионообменной или гель-прони-кающей хроматографии.
Ступенчатое, или периодическое, элюирование используется при препаративных разделениях на колонке. Колонку промывают определенным количеством одного растворителя, а затем используют другой растворитель. Преимуществом такого метода является возможность точного подбора условий, позволяющих получать конкретные компоненты в малых объемах элюата. Возьмем, например, смесь веществ, одно из которых X удерживается
РИС. 8-4.
Простой коллектор фракций.
Измеряется число капель или объем, попадающий в одну пробирку, затем пробирки передвигаются на одну таким образом, чтобы центр следующей находился под отверстием для выхода жидкости. Капли определяются с помощью фотоячейки, содержащей фотоэлемент и маленькую лампочку; каждая капля прерывает луч света и таким образом регистрируется, / — хроматографическая колонка; 2 — фотоячейка.
при использовании растворителя А значительно сильнее, чем другие, а в растворителе Б — гораздо слабее. Следовательно, если колонку вначале длительное время промывать растворителем А, большее количество нанесенного материала будет при этом удалено, однако основная часть вещества X останется связанной. Последующее промывание колонки растворителем Б приведет к быстрому элюированию X в относительно малом объеме.
Третий метод носит название градиентного элюирования, сущность которого состоит либо в изменении соотношения между двумя растворителями, либо в увеличении концентрации одного или более компонентов в растворителе (например, концентрации соли). Последний вариант более распространен при элюировании адсорбционных и ионообменных колонок. Градиенты получают с помощью устройства, схема которого изображена на рис. 8-5. ^Оно состоит из двух сосудов — резервуара и смесительной каме-
ОЙаем элюентпа из смесителя
РИС. 8-5.
Три типа устройств для получения градиента и получающиеся градиенты.
При выходе жидкости из смесительной камеры жидкость из резервуара перетекает в камеру для поддержания постоянного гидростатического давления. Если две жидкости имеют одну и ту же плотность, то высота уровня в обеих камерах будет одинаковой. Нели жидкость Б имеет большую плотность, чем А, уровень в Б будет ниже, чем в А, Линейный градиент получается только при равных объемах резервуара и смесительной камеры. А — резервуар с добавляемым растворителем; Б — исходная концентрация в смесительной камере.
ры, которые соединены внизу между собой. Резервуар содержит более концентрированный растворитель. Жидкость попадает в колонку из смесительной камеры. Поскольку гидростатическое давление (не обязательно высота, поскольку плотности жидкостей в двух сосудах могут отличаться) должно быть одинаковым, жидкость из резервуара постоянно перетекает в смесительную камеру. Если сосуды имеют одну и ту же форму, градиент получается линейным. Как показано на рис. 8-5, можно получить также градиент вогнутой или выпуклой формы.
Хроматография на бумаге
При распределительной хроматографии можно использовать колонки, наполненные целлюлозой. Вариантом этой методики является хроматография на бумаге, где носителем служит целлюлоза
в виде листов бумаги. Целлюлоза содержит значительное количество связанной воды даже после тщательной сушки. Распределение здесь происходит между связанной водой и проявляющим растворителем. Зачастую в качестве растворителя применяют ту же воду. Поэтому резонным будет вопрос, не является ли здесь принципом действия адсорбция? Действительно, некоторые эффекты адсорбции существуют, однако, поскольку физическая структура связанной воды сильно отличается от структуры «свободной» воды, распределение может существовать и в этом случае.
Экспериментальная методика
хроматографии на бумаге
Вместе с изменением вида носителя (от колонки к бумаге) изменяется и техника эксперимента. В бумажной хроматографии нет элюента и вещества различаются по их относительным положениям на бумаге после того, как растворитель пройдет данное расстояние.
Небольшое количество (приблизительно 10—20 мкл) раствора смеси, которую требуется разделить, наносят в отмеченную точку на полоске или листе бумаги (рис. 8-6) и высушивают. Это пятно называется стартовым. Затем бумагу помещают в герметично закрытую камеру и один ее конец погружают в подходящий растворитель (подвижная фаза). Капиллярные силы обусловливают движение растворителя по бумаге, в результате чего образец на старте растворяется и его компоненты движутся в направлении движения растворителя. (Заметим, что образец должен полностью раствориться до начала движения, поэтому одним из факторов, определяющих эффективность разделения, является скорость растворения компонентов в подвижной фазе). Как только фронт растворителя (рис. 8-6) приблизится к противоположному концу бумаги, лист вынимают и сушат. Пятна, которые могут быть как видимыми, так и невидимыми, обнаруживают и их положение отмечают. Отношение расстояний, пройденных пятном и растворителем, обозначается i?/. Величина Rf зависит от вещества, сорта бумаги и природы растворителя.
