Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 7-10.
Два способа использования полых волокон.
А — диализ; когда растворитель течет по волокнам, маленькие молекулы проходят в волокна, что понижает их концентрацию в образце; Б — концентрирование; для этого пучок волокон присоединяют к вакууму, в результате чего растворитель и маленькие молекулы попадают в волокно и таким образом в образце происходит концентрирование макромолекул, /—вход растворителя; 2 — выход растворителя; 3 — волокна; 4 — образец; 5 — запаянный патрубок; 6 — вход воздуха; 7 — разрежение.
Список литературы
Bevre КSzybalski Multi-step DNA—RNA Hybridization Techniques, in “Methods in Enzymology”, vol. 21, edited by L. Grossman and K. Moldave, Academic Press, 1971, pp. 350—382.
Kennell D., Use of Filters to Separate Radioactivity in RNA, DNA, and Protein, in “Methods in Enzymology”, vol. 12A, edited by L. Grossman and K- Moldave, Academic Press, 1971, pp. 686—692.
Millipore Corporation, Molecular Filtration.
Прекрасные брошюры выпускаются фирмами Н. Reeve Angel, Inc. (свойства фильтров из бумаги и стекловолокна), Amicon Corporation (мембраны Диафло), Millipore Corporation (фильтры из нитроцеллюлозы и мембраны Пелликон) и Schleicher and Schuell (фильтры из нитроцеллюлозы).
Задачи
7-1. Предположим, что вам предстоит отделить осадок из ацетонового раствора. Какой фильтр будет в этом случае более пригоден, нитроцеллюлоз-ный или из стекловолокна? Почему?
7-2. Если вы отделяете осадок из водного раствора, какими критериями следует пользеваться, чтобы сделать выбор между фильтрацией и центрифугированием?
7-3. Размер частиц, вероятно, меньше, чем размер пор данного нитро-целлюлозного фильтра, однако они эффективно отделяются на фильтре. Они могут адсорбироваться или давать большие ассоциаты. Как можно различить эти альтернативные возможности?
7-4. Линейные и кольцевые молекулы ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, можно разделить на нитроцеллюлозном фильтре при условии, что скорость потока очень велика. При низкой скорости потока разделения не происходит. Какие молекулы при этом будут оставаться на фильтре? Почему?
7-5. Питательная среда для выращивания биологического материала должна быть стерильной. Обычно стерилизацию проводят путем нагревания раствора до 135°С. Однако это не всегда возможно, так как некоторые компоненты при нагревании могут разлагаться. Объясните, каким образом фильтрация может использоваться для стерилизации. Опишите, какие компоненты должны при этом стерилизоваться и как вы будете это осуществлять.
7-6. При подготовке образцов белка или нуклеиновой кислоты в результате прибавления трихлоруксусной кислоты обычно происходит полимеризация смесей для сцинтилляционного счета. Получающийся полимер нерастворим в кислоте, в то время как мономер растворим. Если эту смесь профильтровать, полимер остается на фильтре, а мономер проходит сквозь него. Все же небольшая часть мономера часто адсорбируется. Если в смеси было 10G имп/мин мономера, 0,02% заполимеризовалось и 0,01% адсорбировалось, фоновая радиоактивность будет достаточно высокой, чтобы давать надежный счет. Приняв, что белки и нуклеиновые кислоты растворимы в щелочи, разработайте методику понижения фона. Определите тип фильтра, который следует использовать, и определите фон, получающийся в результате усовершенствованной методики.
7-7. Предположите, что вы отделяете на фильтре бактериальную массу для того, чтобы перенести ее на новую питательную среду. Перенос осуществляется следующим образом: фильтр помещают в новую среду с последующим помешиванием для смывания бактерий. В серии опытов вы нашли, что число бактерий, снимаемых с фильтра, является функцией общего числа отделенных бактерий, и получили следущие данные:
Чему равен выход с фильтра (приблизительно), если отделили 107, 10б и 105 бактерий? Объясните.
7-8. Хорошо известно, что плепка для диализа адсорбирует как белки^ так и нуклеиновые кислоты. Объясните, каким образом вы сможете определить наличие такой адсорбции в случае данного белка или нуклеиновой кислоты. Ферменты теряют биологическую активность при диализе. Как можно отличить адсорбцию от инактивации для данного фермента?
Число отделяемых бактерий
Количество бактерий, смытых с фильтра, %
5-10» 3-108 1-108 5-107 3-10?
98
100
89
50
35
ЧАСТЬ
РАЗДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ
ГЛАВА
Хроматография
Одной из основных задач биохимии является разделение и идентификация химических соединений. Хроматография — очень эффективный метод для достижения этой цели. Общеизвестно, что метод был разработан в 1906 г, русским ботаником Михаилом Цветом, который разделял растительные пигменты (отсюда и название); однако следует отметить, что в 1855 г. немецкий химик Карл Рунге применил хроматографию на бумаге для разделения неорганических веществ. Более того, Плиний Старший сообщал о разделении красителей на папирусе и существовании хроматографического теста на железо с использованием папируса. Все же хроматография стала по-настоящему серьезным методом только в 1944 г., после работ Арчера Мартина и Джона Синд-жа, получивших Нобелевскую премию за разработку методологии распределительной хроматографии.
