Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
вижной фазами, введены в колонку с 18 теоретическими тарелками (рис. 8-1). В верхней теоретической тарелке (начальной) 256 молекул распределены так, что в каждой фазе находится по 128 молекул. При переходе 128 подвижных молекул с первой теоретической тарелки на вторую они распределяются на ней по 64; оставшиеся на первой теоретической тарелке 128 молекул перераспределяются по 64 в каждой фазе, как показано на рис. 8-1. При продвижении подвижных фаз еще на одну теоретическую тарелку снова происходит перераспределение. После 20 последовательных переносов достигается состояние, изображенное на рис. 8-1. Предположим, что на первой теоретической тарелке находится 256 молекул другого типа (на рис. 8-1 цифры снаружи колонки), которые в 3 раза больше распределяются в неподвижную фазу. На рис. 8-1 показано также их распределение после 20 переносов. Распределение этих двух видов молекул сильно различается, поэтому в результате отделяется значительная часть молекул. Чем больше число теоретических тарелок (т. е. длина колонки), тем лучше разделение. Следует отметить, что при увеличении числа теоретических тарелок вещество распределяется по большей части колонки. В действительности, когда число молекул огромно (т. е. больше 1016), число молекул на первой теоретической тарелке отличается от нуля. С другой стороны, степень распределения уменьшается в том смысле, что большая доля вещества находится на небольшой части теоретических тарелок. Например, после 8 переносов 40% молекул, которые на рис. 8-1 распределяются 1:1, содержится в 4/в теоретических тарелок, после 20 переносов 40% содержится уже в 6/i6, или 3/8, теоретических тарелок. Отсюда ясно, что в идеальном случае, когда разделение определяется только распределением, разделение двух веществ будет более эффективным при увеличении длины колонки.
Примеры распределительной хроматографии
Чаще всего используют два типа распределительной хроматографии — хроматографию на бумаге и тонкослойную. В обоих случаях носитель содержит связанную жидкость: молекулы воды связаны с целлюлозой при хроматографии на бумаге, а при тонкослойной хроматографии с носителем связан растворитель, используемый для получения тонкого слоя (см. разд. «Тонкослойная хроматография»). (Эти методы иногда рассматривают как разновидность адсорбционной хроматографии, поскольку степень разделения зависит и от эффектов адсорбции, однако основным процессом здесь является распределение.) Другими примерами распределительной хроматографии служат газожидкостная и гель-проникающая хроматография, которые будут подробно рассмотрены ниже.
Распределительная хроматография может осуществляться и на колонках, содержащих носитель, который не адсорбирует растворенные вещества. Распространенными материалами являются диатомовая земля (например, целит), силикагель, порошок целлюлозы и некоторые сшитые декстраны (например, сефадекс LH20). Неподвижную фазу готовят путем суспендирования носителя или промывания колонки выбранным сорбентом. При этом сорбент либо покрывает частицы носителя, удерживаясь на них за счет адсорбции, либо просто проникает в промежутки между частицами и удерживается там под действием капиллярных эффектов. При этом важно добиться того, чтобы неподвижная фаза не заполняла пространство между частицами, которое предназначено для прохождения подвижной фазы. Типичными материалами для неподвижных фаз в случае разделения неполярных веществ служат гидрофобные растворители, такие, как бензол; для разделения полярных соединений применяют гидрофильные растворители, например спирты. Подвижными фазами при разделении неполярных веществ служат обычно спирты или амиды, а для полярных— вода. Обратите внимание, что в качестве неподвижной фазы используются жидкости.
Распределительную хроматографию в первую очередь применяют для разделения низкомолекулярных веществ. Для уменьшения диффузии, которая приводит к уширению пиков, необходимо добиваться очень маленьких стартовых зон и максимальной скорости разделения. Конкретные методики будут приведены в разделах, посвященных хроматографии на бумаге и тонкослойной хроматографии.
Адсорбционная хроматография
Теоретические основы
адсорбционной хроматографии
Рассмотрим поверхность твердого тела, содержащую множество разнообразных центров связывания, например участки, богатые электронами (отрицательно заряженные), бедные электронами (положительно заряженные), неполярные и т. д., и жидкость, содержащую растворенное вещество, находящуюся в контакте с такой поверхностью. Если связывание обратимо, то число молекул, связанных с поверхностью, будет пропорционально концентрации растворенного вещества. Эта зависимость может быть трех типов (рис. 8-2). Такие кривые называются изотермами адсорбции. Чаще всего встречается восходящая кривая, которая соответствует первоочередному связыванию по центрам, обладающим большим сродством, так что дополнительные количества растворенного вещества связываются менее прочно. Изотерма связыва-
РИС. 8-2.
