Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
белку. Хотя все эти требования редко удается выполнить полностью, тем не
менее с помощью реконструированных систем можно получить много полезной
информации о структуре и функциях мембран и белков. Кроме того, здесь
всегда есть неограниченный простор для дальнейших усовершенствований.
3.1. Общие методы реконструкции
Реконструкцию обычно начинают, взяв смешанные мицеллы, состоящие из
очищенного белка, детергента и липида (эндогенного или экзогенного).
Иногда мицеллы состоят только из белка и детергента: необходимость липида
для стабилизации исследуемого белка можно установить, как описано выше.
Если липид не был добавлен в процессе солюбилизации или очистки белка
(или если требуется добавить его дополнительно), то это, как правило,
делают на стадии приготовления мицеллярного раствора, чтобы получить
конечное мольное отношение липид/белок (обозначаемое здесь как ф), равное
2000-10 000. Такой избыток липида обычно требуется тогда, когда
реконструированные везикулы используют для исследований транспортных
процессов, хотя в некоторых случаях более приемлемыми могут быть
отношения 100-2000. Липид можно добавить в виде детергент-липидных мицелл
или наслоить его на дне колбы в виде тонкой пленки, над которой затем
перемешивать детер-
Солюбилизация н реконструкция мембранных белков
215
гент-белковый раствор до тех пор, пока в него не перейдет весь липид.
Желательно все липидные суспензии хранить в атмосфере инертного газа.
3.1.1. Удаление детергента
Для формирования везикул необходимо удалить детергент из смешанных
мицелл, так чтобы самопроизвольно мог образоваться фосфолипидный бислой.
Чаще всего детергент удаляют с помощью диализа. Мицеллярный раствор
наливают в целлофановый мешочек и диализуют против большого объема
буфера, не содержащего детергента (обычно на холоду). Как правило,
используют 200-кратный избыток буфера по отношению к объему диализуемого
раствора с тремя или четырьмя сменами в течение нескольких суток.
Преимущество этого метода состоит в его простоте: можно одновременно
диализовать несколько образцов (содержащих, например, различные липиды),
при этом не требуется ни специального оборудования, ни особого контроля
за ходом диализа. Недостаток состоит в том, что для удаления детергента
требуется много времени. Кроме того, что это создает определенные
неудобства, длительный контакт с детергентом может привести к повреждению
некоторых мембранных белков. По-видимому, образование детергент-белковых
мицелл неизбежно происходит даже при избытке липида (рис. 5.1). Если по
каким-либо причинам ингибиторы протеолитических ферментов не были
добавлены при солюбилизации или очистке белка, то может оказаться
полезным добавить их на стадии удаления детергента.
Скорость удаления детергента зависит от многих факторов, но в любом
случае надо стремиться к тому, чтобы остаточное содержание детергента не
превышало 0,02% (в/о) или было в 100 раз ниже первоначального уровня. По-
видимому, чаще всего при диализном методе реконструкции в качестве
детергента используют холат. Тритон Х-100 трудно удалить диализом,
поскольку этот детергент имеет низкую ККМ. Поэтому его редко применяли
для реконструкции, пока не выяснилось, что гидрофобные смолы бнобидс SM-2
и амберлит XAD-2, адсорбирующие детергенты, могут ускорить удаление
тритона Х-100 [53, 33]. С этой целью предварительно промытые смолы просто
добавляют к диализующему буферу. Такой способ удаления детергента был
использован для реконструкции натриевого канала [37].
При другом методе реконструкции смешанный мицеллярный раствор разбавляют
до концентрации ниже ККМ солюбилизирующего детергента, в результате чего
липиды и белки ассоциируют с образованием везикул. Оставшийся в везикулах
детер-
?16
Глава Б
гент можно затем удалить гель-фильтрацией или кратковременным диализом.
Этот подход впервые применялся для реконструкции цитохромоксидазы,
солюбилизированной холатом [54], а недавно был использован для
реконструкции родопсина [55]. Процедура реконструкции состоит в
следующем.
1. Не содержащий липидов родопсин, солюбилизированный октилглюкозидом,
добавляют к тонкой пленке яичного фосфатидилхолина (ФХ) (ф=80-300),
перемешивают на встряхива-теле типа вортекс и выдерживают при 4°С в
течение 4 ч.
2. Полученный раствор добавляют по каплям к быстро перемешиваемому буферу
так, чтобы снизить концентрацию ок-тилглюкозида до 10 мМ (р<-9).
3. Удаляют детергент диализом против 18-кратного избытка буфера и
концентрируют везикулы на мембране амикон РМ-10.
Детергент можно также удалить с помощью гель-фильтра-ции липидно-белково-
детергентного раствора. По мере прохождения смеси через колонку
концентрация детергента в ней снижается, благодаря чему формируются
липидно-белковые везикулы. Гель-фильтрация оказалась очень эффективной
при реконструкции таких мембранных белков, как АцХР [28], Са2 Mg2+-ATPa3a
[9] и белок, участвующий в транспорте лактозы [56]. Преимуществом этого
