Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
211
Таблица 5.5. Выделение мембран из электрических органов Torpedo
californica
(см. также табл. 3.6)
Все операции выполняют при 0-4 СС как можно быстрее.
1. Частично размораживают 200 г электрических органов Т. californica,
нарезают ножницами или скальпелем на небольшие куски (1 см3) и помещают
их в стакан емкостью 600 мл.
2. Добавляют 200 мл буфера для гомогенизации (БГ-4, см. ниже).
3. Добавляют, постоянно перемешивая, 0,4 г иодацетата и 0,2 мл 200 мМ
ФМСФ (в этаноле), чтобы получить концентрацию иодацетата 1 мг/мл и ФМСФ
0,1 мМ (оба вещества являются протеазными ингибиторами).
4. Гомогенизируют четыре раза по 30 с с помощью гомогенизатора полнтрон
PCU-2 (фирмы Brinkrnann) на уровне мощности 7.
5. Центрифугируют при 5500 об/мин (5000 g) в течение 10 мин в роторе Sor-
vall GSA [или при 6500 об/мин (5000 g) в роторе SS-34],
6. Фильтруют надосадочную жидкость через четыре слоя марли.
7. Прн желании можно ресуспендировать осадок, полученный после
центрифугирования, в 80 мл буфера БГ-4 и повторить операции 3-6, добавив
0,2 г иодацетата и 0,1 мл ФМСФ.
8. Объединенный фильтрат центрифугируют в роторе Ту 35 (Beckman) при 30
000 об/мин в течение 60 мин или в роторе Ту 19 при 19 000 об/мин в
течение 125 мин. (При крупномасштабном выделении может потребоваться
несколько центрифугирований в роторе Ту 35.)
9. Суспендируют осадок в 5-10 мл буфера для диализа (БД-1). Чтобы
получить гомогенную суспензию, следует использовать ручной гомогенизатор.
Разливают суспензию по морозостойким пробиркам и замораживают в жидком
азоте.
Буфер для гомогенизации БГ-4
10 мМ фосфат натрия (1,38 г NaH2P04 на 1 л)
5 мМ ЭДТА (1,85 г/л)
5 мМ ЭГТА (1,90 г/л)
0,02%-ный Na.\3 (0,2 г/л) pH 7,5
Буфер для диализа (БД-1)
100 мМ NaCI (5,84 г/л)
10 мМ MOPS (2,09 г/л)
0,1 мМ ЭДТА (0,037 г/л)
0,02%-ный NaN3 (0,2 г/л) pH 7,4
можно предотвратить, включая в солюбилизирующие смеси лиганды или
субстраты. Эти лиганды, по-видимому, фиксируют белок в стабильном
конформационном состоянии. Например, эксперименты, проведенные с ^-
андренэргическим рецептором, показывают, что именно агонисты, но не
антагонисты, оказывают защитное действие на белок в ходе солюбилизации
дезоксихо-латом [50]. Подобная стабилизация наблюдалась при реконструкции
АТРаз за счет включения АТР в инкубационную среду [33, 51] и
сукцинатдегидрогеназы за счет добавления сукцина-та [52].
14*
212
Глава 5
Таблица 5.6. Солюбилизация и очистка ацетилхолинового рецептора
электрического органа Torpedo
Все операции проводят при 0-4 °С.
1. Размораживают фракцию мембран Torpedo, выделенную из 200 г
электрических органов.
2. Разбавляют препарат до концентрации 2 мг/мл по белку буфером БД-1 (см.
табл. 5.5) (для мембран, выделенных из 200 г тканн, достаточно 200 мл).
3. Постоянно перемешивая, добавляют 10 мл 20%-ного холата натрия (в
буфере БД-1), чтобы конечная концентрация холата составила 1%.
4. Осторожно перемешивают в течение 20 мин.
5. Центрифугируют при 34 000 об/мин в роторе Ту 35 в течение 45 мнн. За
это время подготавливают колонку для аффинной хроматографии для очистки
ацетилхолинового рецептора, промыв ее буфером (см. п. 7).
6. Отделяют надосадочную жидкость и оставляют ее для дальнейшей очистки с
помощью аффинной хроматографии на колонке.
7. Промывают колонку с аффигелем 401/бромацетнлхолином буфером БД-2 (БД-
1+1%-нын холат). (Процедура подготовки колонки описана в табл. 5.7.)
8. Наносят надосадочную жидкость на колонку (объемом 25 мл) со скоростью
1,5 мл/мин.
9. Пропускают через колонку не менее трех объемов (75 мл) буфера БД-3
(БД-1+1%-ный холат+1 мг/мл ДОФХ)1).
10. В ходе промывания собирают фракции и измеряют их оптическую плотность
при 280 нм. В конце промывки оптическая плотность должна быть иа уровне
базовой линии.
11. Элюируют ацетилхолиновый рецептор 50 мл буфера БД-4 (БД-З+ЮмМ
карбамилхолинхлорид), приготовленного растворением 91 мг твердого
карбамилхолннхлорида в 50 мл буфера БД-3. Собирают фракции по 2 мл,
измеряя их оптическую плотность при 280 нм.
12. Объединяют фракции, составляющие хроматографический пик (обычно это
фракции с Л2зо>0,5), и определяют общий объем и среднее значение Л28о-
Концентрацию белка (в мг/мл) рассчитывают как 0,6-Л28о-
13. Хранят очищенный ацетилхолиновый рецептор при 0-4°С. Очищенные
фракции как можно быстрее используют для реконструкции.
14. Промывают колонку несколькими объемами буфера БД-1, а затем 0,01 М
ацетатом (pH 4).
') ДОФХ (фирма Avanti) высушивают в вакууме и суспендируют в буфере БД-1
+ + 1%-ный холат. Обычно 10 мл раствора ДОФХ (20 мг/мл в хлороформе)
упаривают на роторном испарителе, сушат 1-3 ч в вакуумном эксикаторе и
затем растворяют в 200 мл буфера БД-3. 50 мл буфера БД-3 оставляют для
стадии 11. В случае необходимости именно на этой стадии можно заменить
одни липид на другой или довести соотношение ЛНП'1Д : белок до нужной
величины.
Таблица 5.7. Подготовка колонки для очистки ацетилхолинового рецептора с
