Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
медную сеточку, покрытую парлодием с напыленным углеродом, тщательно
промыты буфером или 1%-ным уралнилацетатом и затем контрастированы 1%-ным
уранилацетатом. Образцы исследовали на электронном микроскопе Филлипс ЕМ
400 при напряжении 100 кВ.
Солюбилизация н реконструкция мембранных белков
мое визуальное исследование биологического материала под электронным
микроскопом. Прн этом методе исключены артефакты, вызываемые
контрастированием и дегидратацией образца, а сам объект исследуется в
подходящем для него ионном окружении.
3.2.2. Гель-фильтрация и другие методы
Размеры и степень гомогенности реконструированных везикул часто можно
определить с помощью гель-хроматографии, используя крупнопористые
носители. Хроматографические колонки можно откалибровать по латексным
частицам стандартных размеров. Имеются данные, что размеры липосом,
определенные с помощью электронной микроскопии и гель-фильтрации на
калиброванных колонках, хорошо согласуются между собой [8J. Метод
калиброванных колонок обладает тем преимуществом, что он позволяет очень
просто найти распределение белка по везикулам разных размеров. Основной
же его недостаток состоит в длительности элюирования (до нескольких
суток). Кроме того, есть опасность, что из-за контакта с гелем может
измениться характер распределения везикул по размерам, а также произойти
адсорбция анализируемых веществ на колонке.
Реконструированные везикулы можно охарактеризовать и с помощью
центрифугирования [70J. Фонг и Мак-Нэми [71] проводили центрифугирование
реконструированного АпХР в градиенте плотности сахарозы, чтобы установить
наличие мембранных фракций с разным содержанием белка. Если до
центрифугирования образец подвергали замораживанию -оттаиванию, то эти
фракции, по-видимому, сливались, давая один большой пик. Однако, судя по
данным электронной микроскопии, популяция везикул оставалась более
гетерогенной, чем это следовало из результатов градиентного
центрифугирования (J. Earnest, неопубликованные данные).
3.3. Факторы, определяющие морфологию реконструированных мембран
Размеры и форму реконструированных мембранных везикул часто бывает
необходимо знать при измерениях функциональной активности интегральных
мембранных белков. Например, активность ионных каналов обычно определяют
по эффективности захвата радиоактивно меченных ионов замкнутыми
реконструированными везикулами. Полезно помнить, что везикула диаметром
25 нм (именно такие везикулы обычно образуются при хо-латном диализе)
имеет внутренний объем 2-10-18 мл и будет
222
Глава 5
содержать всего одну молекулу растворенного вещества при его концентрации
1 мМ [72]. Поэтому даже если реконструированные мембраны имеют каналы,
позволяющие ионам проникать в везикулы, из-за малого внутреннего объема
последних могут возникнуть затруднения прн измерении функциональной
активности белка. Другой важной характеристикой реконструированных
мембран является ориентация белка в бислое. Часто бывает трудно
количественно оценить активность белка в реконструированной системе, если
его ориентация в мембране точно не установлена и если не гарантирована
целостность везикулярного бнслоя. Этим характеристикам реконструированных
мембран всегда нужно уделять самое серьезное внимание (см. ниже).
3.3.1. Отношение липид/белок
Как известно, in vivo некоторые мембраны существуют в виде замкнутых
везикул даже при низком отношении липид/белок; в то же время в случае
реконструированных мембран это невозможно. Например, АцХР-содержащие
мембраны из электрических пластинок Torpedo californica можно выделить в
виде крупных (400 нм в диаметре) замкнутых везикул, имеющих мольное
отношение липид/белок (tp) около 300. Однако реконструированные АцХР-
мембраны с отношением tp=300 представляют собой преимущественно
незамкнутые бислойные фрагменты, для которых не удается измерить
внутренний объем (J. Earnest, неопубликованные данные). Молекулярные
основы такого явления неясны; возможно, в стабилизации нативной мембраны
участвуют цитоскелетные структуры, отсутствующие в реконструированных
системах. Большинство исследований по реконструкции мембранных белков,
функционирование которых сопровождается захватом ионов, были наиболее
успешными при Ф = 8000-12 000. Впрочем, остается неясно, для чего
необходим избыток липидов -для обеспечения непроницаемости мембраны или
для формирования везикул максимального размера.
3.3.2. Тип детергента
Размер везикул может зависеть от типа детергента, присутствующего в
смешанных белково-липидно-детергентных мицеллах. Например, мицеллы,
содержащие холат, яичный фосфати-дилхолин и гликофорин, образуют везикулы
диаметром 25 нм с внутренним объемом 2-10-18 мл, хотя идентичные во всех
отношениях мицеллы, содержащие октплглюкозид вместо холата, образуют
везикулы диаметром 230 нм с внутренним объемом 5-10-15 мл [72]. Эти
исследования показали также, что морфология везикул зависит и от
исходного соотношения детергент/
