Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
скоростей латеральной диффузии методом НФМ необходимо одновременно
учитывать и диффузию (или поток), и кинетику обесцвечивания, для чего
требуется вводить дополнительные параметры. Поэтому данный метод лучше
всего применять для изучения систем с простыми диффузионными свойствами.
В то же время метод НФМ на несколько порядков чувствительнее, чем
стандартный метод ВФФ [82]; с его помощью удается оценить коэффициенты
диффузии минорных мембранных белков, например гормонов или рецепторов
вирусов.
Указанные методы позволяют определить характер транспортного процесса
(диффузия или поток), коэффициент диффу-
Биофизические подходы
371
зии D и/или скорость потока, а также долю подвижного флуо-рофора [83].
Диапазон значений D, которые можно измерить обоими методами, составляет
от 10-в до 10-12 см2/с [80, 81]. Частицы, для которых D<10-12 см2/с,
обычно считаются неподвижными (иммобилизованными). У подвижных мембранных
белков D достигает 10-8 см2/с.
Метод ВФФ позволяет не только оценить коэффициент диффузии, но и подойти
к выявлению процессов, регулирующих подвижность мембранных белков. Рис.
8.11, например, иллюстрирует влияние состояния цитоскелета эритроцитов на
кинетику восстановления флуоресценции и на размеры иммобилизованной
фракции белка полосы 3 эритроцитарной мембраны. Другие примеры приведены
в работе [80].
4.4. Латеральная диффузия липидов
В отличие от диффузии белков латеральную диффузию липидов изучают с
помощью целого ряда экспериментальных подходов.
80 40 О
fit) 100 30
20
10
О
•
I I I 1---------1--1
О БОО 1200 О 300 БОО
Время после обесцвечивания
Рис. 8.11. Экспериментальные данные (точки) и соответствующие им
теоретические кривые ВФФ окрашенных эозином теней эритроцитов при pH 7,4
и различных температурах и концентрациях солей. Эозин был связан
исключительно с белком полосы 3. Параметр f(t)-это степень восстановления
флоурес-ценции (в процентах) в момент времени t относительно исходного
уровня. А. 21 °С, 5 мМ фосфат натрия. Б. 37 °С, 13 мМ фосфат натрия. В.
21 °С, 46 мМ фосфат натрия. Г. 37 °С, 46 мМ фосфат натрия. Обратите
внимание на значительные различия в характерных временах (т. е. в
коэффициентах диффузии) и в размерах мобильной фракции белка. Условия
проведения эксперимента влияют в основном на структуру цитоскелета
эритроцитов, который в свою очередь регулирует латеральную диффузию белка
полосы 3. (Из работы [84]
с разрешения авторов).
372
Глава 8
4.4.1. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечиввнив
Метод ВФФ с равным успехом применим и к содержащим ковалентно связанный
флуорофор липидным молекулам; в настоящее время, вероятно, этот подход
наиболее популярен. Диапазон коэффициентов диффузии для липидов
составляет от 10-7 до 10_и см2/с [80] и лучше соответствует возможностям
ВФФ, чем в случае белков. Обычно для достижения достаточно высокого
соотношения сигнал/шум эксперименты по фотообесцвечиванию проводят в
условиях, при которых молярное отношение меченых и немеченых липидов
составляет около 0,01; если применяют метод НФМ, доля меченых липидов
может быть значительно ниже. Получаемая таким образом величина D
представляет собой коэффициент диффузии меченых молекул липидов в
окружении немеченых, а если структурно эти два типа молекул различаются
слабо, можно надеяться, что это значение близко к коэффициенту
самодиффузии немеченых липидов. Тем не менее приходится констатировать,
что объемный флуорофор будет оказывать существенное возмущающее влияние
на микроокружение зоида. Это может сказаться на вычисляемой величине D,
особенно при низких подвижностях зонда в "твердом" бислое.
4.4.2. ЭПР слин-меченных липидов
Случайным образом диффундирующие в плоскости мембраны спин-меченные
липиды сталкиваются друг с другом. При этом возникает спин-спиновое
обменное взаимодействие, приводящее к уширению сигналов ЭПР (разд.
3.3.2). Поскольку частота столкновений прямо зависит не только от
концентрации метки, но и от коэффициента диффузии D, зная ширину линий,
можно определить D для спин-меченных молекул. Обычно для этого используют
концентрации спиновых меток в пределах 0,1-0,4 от количества немеченых
липидов. Коэффициент диффузии D и ширина линий связаны довольно простым
соотношением, с помощью которого легко оценить D [66, 85, 86]. Следует
отметить, что, как и для ВФФ, объемные спиновые метки непременно окажут
влияние на организацию липидов в бислое, а следовательно, и на их
диффузию.
4.4.3. ЯМР
Важное преимущество метода ЯМР перед всеми остальными рассмотренными в
разд. 4.4 методами состоит в том, что ЯМР-метки никак не влияют на
динамические свойства исследуемых липидов. Но здесь существуют свои
проблемы.
Точное значение D можно прямо определить с помощью
Биофизические подходы
373
импульсных 'Н-ЯМР-методов, в частности, методом спинового эха в градиенте
магнитного поля. Однако этот способ применим лишь к макроскопически
ориентированным липидным бислоям. Кроме того, для липидов в состоянии
