Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
исследования флип-флоп-переходов фосфолипидов. Для этого вносят
асимметрию в распределение ядер 13С в полярных головках липидов, вводя
13С-фосфолипиды в наружный монослой с помощью белков фос-фолипидного
обмена (гл. 4). Трансбислойную диффузию 13С-меченных липидов во
внутренний монослой регистрируют, следя за интенсивностью сигнала ядер
13С в отсутствие или в присутствии смещающих реагентов [99] (рис. 8.12).
Как видно из ри-
Трис
Рис. 8.12. Спектры 13С-ЯМР диолеилфосфатидилхолина с меченой гидрофильной
головкой в составе липосом нз димиристоилфосфатидилхолина. Спектры
снимали через 1 ч н 22 ч после введения меченого липида в наружный
монослой везикул с помощью белка фосфолипидного обмена. Перед
регистрацией в среду добавляли раствор DyCl3 (конечная концентрация 2
мМ). (Из работы [99] с разрешения авторов.)
376
Глава 8
сунка, относительно быстрые флип-флоп-переходы связаны с неравновесным
распределением небольшого количества диолеил-фосфатидилэтаноламина в
димиристоилфосфатидилхолиновых везикулах и не наблюдаются в везикулах,
состоящих только из одного фосфолипида [99].
Метод ЯМР неприменим к целым клеткам из-за недостаточного разрешения
спектров.
5. Взаимодействия белок - липид
На первый взгляд липидный бислой, в который погружены интегральные
мембранные белки, кажется достаточно инертным растворителем белковых
глобул с гидрофобной поверхностью. Во многих случаях, однако, из-за
разнообразия природы белково-липидных взаимодействий молекулы
фосфолипидов, непосредственно контактирующие с белком, приобретают особые
свойства (например, меньшую подвижность, измененную упорядоченность,
избирательность в связывании липидов). Белок может влиять на конфигурацию
и подвижность даже тех молекул липида, которые не находятся в контакте с
ним. Белково-липидные взаимодействия могут приводить и к изменению
конформации белка. В некоторых нетипичных случаях белок даже содержит
несколько очень важных в функциональном отношении липидсвязывающих
центров, характеризующихся высоким сродством к определенным липидам. Это
могут быть как интегральные, так и периферические белки.
Более детальное описание рассмотренных ниже методов можно найти в обзоре
[100].
5.1. Характеристика белково-липидного связывания
В этом разделе мы остановимся на методах выявления связанных с белком
липидов и методах определения таких характеристик белково-липидных
комплексов, как время жизни, стехиометрия и специфичность.
5.1.1. ЭПР
Впервые влияние мембральных белков на свойства липидного окружения
удалось обнаружить методом ЭПР спин-меченных липидов [101]. Сейчас
достоверно доказано, что спектры ЭПР природных или реконструированных
мембран, содержащих в небольшом количестве спин-меченные липиды, можно
представить в виде суммы двух спектров, отвечающих "иммобилизованным" и
подвижным липидным молекулам, причем спектр последних практически не
отличается от спектра бислоев, не содержащих
Биофизические подходы
377
белка. Соответствующий пример приведен на рис. 8.13. Большинство авторов
склонны считать, что "иммобилизованная" липидная фракция представляет
собой наиболее глубокие, примыкающие к молекуле белка слои липидных
молекул (так называемые аннулярные липиды) [66, 100, 101], а не молекулы
фосфолипида, "зажатые" между агрегированными белками [102-105].
Важно отметить, что основываясь на результатах ЭПР-изме-рений, к классу
"иммобилизованных" относят липидные молекулы или их участки, времена
вращательной корреляции которых превышают примерно 10-7 с ([48, 66]; см.
также разд.3.4.2). Таким образом, "иммобилизованные" липиды все еще могут
обладать значительной подвижностью, и в частности, могут обмениваться с
другими липидными молекулами со скоростью до 107 с-1 [43, 48, 66]. ЯМР-
измерения показали, что такой обмен действительно происходит [43, 100].
Если молекулы липидов обмениваются быстрее, чем 107 раз в секунду
(например, при повышении температуры), обусловленные аннулярными липидами
сигналы ЭПР частично усредняются с сигналом от общего
Рис. 8.13. Спектры ЭПР стеариновой кислоты, меченной по положению С14, в
составе мембран нз ректальной железы акулы, содержащих (Na+, К+)-АТРазу,
и в выделенном из мембран препарате суммарных фосфолипидов. 1 - мембраны;
2 - водная суспензия экстрагированных мембранных липидов; 3 - "подвижный"
компонент: спектр получен вычитанием спектра иммобилизованной метки (5)
из спектра мембран; 4 - разностный спектр иммобилизованного компонента,
полученный вычитанием спектра липида из спектра мембран. 7=0 °С.
"Иммобилизованному" компоненту спиновой метки отвечают в спектрах 1, 4 к
5 широкие "крылья" вокруг центральной линии (указаны стрелками). (Из
работы [104] с разрешения авторов.)
25-1488
378
Глава 8
пула липидов. Это приводит к уменьшению вклада в спектр компонента с
ограниченной подвижностью [100].
Предполагая, что ЭПР-сигнал "иммобилизованного" типа полностью связан с
аннулярными липидами, можно оценить число фосфолипидных молекул,
