Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
расположение этих двух типов молекул в плоскости мембраны.
Применение избирательного дейтерирования молекул фосфолипидов не
ограничивается модельными мембранами; меченые
" а/2 "
Рис. 8.7. Кривые плотности рассеяния нейтронов на бислое нз
недейтернрован-мого дипальмнтоплфосфатпднлхолнна в фазе Lp* (сплошная
линия) н распределения молекул воды (пунктир). Средние положения меток в
соответствующих дейтерированных липидах указаны вертикальными линиями.
Расстояние измеряется от центра бислоя. Содержание воды в образце
составляет 6% (в/в); измерения проводили при 20°С. Отметим, что различные
метки в полярной фисфохолиновон головке расположены очень близко друг к
другу (в проекции), т. е. головки располагаются почти параллельно
плоскости мембраны. Как видно из рисунка, вода проникает вплоть до
глицеролового остова. (Из работы [40] с разрешения авторов.)
Биофизические подходы
359
липиды можно ввести и в биологические мембраны. Следует, однако,
отметить, что синтез дейтерированных фосфолипидов - довольно долгая
процедура.
3.2.2. Ядерный магнитный резонанс
Метод ЯМР основан на измерении энергии радиочастотного электромагнитного
излучения, поглощаемой при переходах ядер из одного спинового состояния в
другое при наложении сильного магнитного поля. ЯМР - один из наиболее
мощных методов исследования мембран: он позволяет наблюдать за отдельными
ядрами и изучать их окружение и подвижность (общее представление о методе
можно получить из книги [42]). В ранних работах для исследования
биологических мембран и липидных систем применяли в основном 'Н-ЯМР. В
последние годы, однако, более популярным становится магнитный резонанс на
ядрах 2Н, 13С и 31Р (подробности см. в работах [43, 44]).
1. Определение статической упорядоченности методом 2Н-ЯМР. Жирнокислотные
"хвосты" фосфолипидных молекул, образующие "твердую" ламеллярную мезофазу
(так называемое состояние геля), находятся в полностью упорядоченной
конфигурации (полностью-транс). Выше температуры фазового перехода (в
"жидком" бислое) может происходить быстрая транс-гош-изомеризация,
приводящая к разупорядочению бислоя. Усредненная по времени ориентация
данного сегмента цепи полностью описывается степенью локальной
упорядоченности Si;
S, = V2(3cos20-1), Щ
где 0 - мгновенный угол между направлением сегмента и нормалью к
плоскости ламеллы, а черта означает усреднение по времени. Величина Si
пропорциональна так называемому квад-рупольному расщеплению сигналов 2Н-
ЯМР, прямо определяемому из спектров дейтерированных липидов, встроенных
в модельные системы или биологические мембраны [43].
2. Выявление гексагональных фаз в липидах методом 31Р-ЯМР. Спектры 3Ф-ЯМР
фосфолипидов, образующих небислой-ные и бислойные структуры, существенно
отличаются друг от друга, и метод 31Р-ЯМР можно использовать в качестве
чувствительного инструмента для выявления иебислойных фаз или переходов
бислой - небислой [45]. Это особенно важно в случае
фосфатидилэтаноламина, который в физиологических условиях образует
гексагональную мезофазу (Нп) и в то же время является основным
компонентом липидных бислоев биологических мембран. Еще одним примером
такого рода является поведение кардиолипина в присутствии Са2+ [45].
Положение и форма
360
Глава 8
сигналов 31Р-ЯМР фосфатидилэтаноламина при температурном переходе от
ламеллярной мезофазы к гексагональной существенно изменяются (рис. 8.8).
Применение метода 31Р-ЯМР для изучения стабильности бислоев подробно
рассмотрено в работе [47].
Н ->
Рис. 8.8. Спектры 31Р-ЯМР водной суспензии дноленлфосфатндилэтаноламнна
при разных температурах. При 5°С липид находится в ламеллярной фазе (La),
а при 20С'С - в гексагональной (Ни). (Из работы [46) с разрешения
авторов.)
Биофизические подходы
361
3.2.3. Другие методы
Впервые параметры, характеризующие упорядоченность, были определены
методом ЭПР спингмеченных жирных кислот (см. обзор [48]). Однако
результаты измерения упорядоченности вдоль углеводородной цепи,
полученные методами ЭПР и 2Н-ЯМР, отличаются друг от друга. По-видимому,
в основном это различие обусловлено влиянием массивных спиновых меток
[49], но отчасти оно может быть связано с различиями временных шкал этих
методов [50].
Степень упорядоченности можно также оценить, измеряя кинетику
деполяризации флуоресценции (или характерное время спада так называемой
анизотропии флуоресценции) соответствующих молекул, либо "растворенных" в
липидном бислое, либо ковалентно пришитых к молекулам липидов, после
возбуждения флуоресценции импульсом поляризованного света [51, 52].
Показано, что существует однозначная связь между предельным значением
степени анизотропии флуоресценции и степенью упорядоченности. Аналогичное
соотношение наблюдается и тогда, когда вместо кинетики флуоресценции
измеряется стационарная степень анизотропии флуоресценции при непрерывном
освещении (определить ее значительно легче) [53, 54]. Как и в случае 2Н-
ЯМР, для измерения степени упорядоченности вдоль всей углеводородной цепи
