Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
точно оценить содержание р-складчатых структур. Различить
Биофизические подходы
353!
а-спирали и неупорядоченные структуры по инфракрасным спектрам довольно
трудно; более предпочтительными в этом-отношении являются спектры
комбинационного рассеяния.
Долгое время ИК-спектроскопию практически не применяли для исследования
водных суспензий или растворов мембран и мембранных белков из-за сильного
поглощения воды. Возможности метода были расширены в последнее время в
связи с применением в ИК-спектроскопии фурье-анализа [31]. Комбинационное
рассеяние света молекулами воды мало и не мешает анализу.
Отметим, что концентрация белка, необходимая для измерения ИК- или
рамановских спектров водных растворов, составляет около 10 мг/мл, что на
два порядка выше, чем при измерении КД.
2.5. Подвижность участков белковой молекулы
За последние годы был достигнут значительный прогресс в изучении
внутренней Подвижности водорастворимых белков [33].. Для изучения
гибкости и подвижности частей полипептидного остова, а также подвижности
аминокислотных остатков в кристаллах белков исследовали влияние
температуры на распределение электронной плотности, получаемое методом
рентгеновской дифракции. С помощью ЭПР высокого разрешения исследовали
вращение аминокислотных остатков белков в водном растворе [33]. Измерение
в наносекундном диапазоне кинетики уменьшения анизотропии флуоресценции
позволило оценить скорость вращательной диффузии остатков триптофана
[34]. Для исследования мембранных белков эти методы начали применять лишь
недавно. В то же время изучение бактериородо-псина с помощью 2Н-ЯМР
показало большую ценность систематических исследований динамики
мембранных белков. В этой работе в молекулы бактериородопсина вводили
путем биосинтеза дейтерированные аминокислоты. Узкие пики 2Н-ЯМР-спект-
ров, свидетельствующие о высокой подвижности меченых групп, отвечали
остаткам, локализованным на поверхности белковой глобулы, а широкие
линии, свидетельствующие об ограниченном движении, - остаткам, спрятанным
внутри ее. Установленное таким образом положение различных меченых
остатков неплохо согласуется с данными, полученными другими методами
[35].
3. Структура липидов в составе биологических мембран и модельных
систем
В биофизических исследованиях липидного компонента биологических мембран
очень важную роль играют модельные системы, состоящие только из липидов.
Это связано с тремя причинами.
354
Глава 8
1. Пригодные для физических исследований чистые и хорошо
охарактеризованные образцы значительно легче получить искусственным путем
из липидов (выделенных или синтезированных), чем из мембранных белков.
2. Чистые липиды спонтанно формируют протяженные структуры, сходные с
липидными структурами в биологических мембранах, что позволяет,
основываясь на результатах исследования таких систем, делать выводы о
строении природных мембран.
3. Результаты структурных исследований изолированных липидов легче
интерпретировать, чем данные, полученные на природных мембранах;
следовательно, изучение искусственных систем может способствовать
определению структуры липидов природных бномембран и пониманию их
функциональных свойств.
3.1. Обнаружение фазовых переходов
Липиды могут находиться в разных фазовых состояниях [36, 37]. Обычно
первый шаг в изучении подобных систем состоит в построении фазовых
диаграмм, т. е. зависимости температуры фазовых переходов от концентрации
компонентов, и выявлении на диаграмме областей, соответствующих различным
фазовым состояниям. Для регистрации температурных фазовых переходов
используют несколько методов [37].
3.1.1. Калориметрия
Большинство температурных фазовых переходов можно регистрировать
калориметрически. Современные методы - дифференциальный термический
анализ (ДТА) и особенно дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)-
значительно облегчили проведение подобных измерений и в то же время
увеличили чувствительность. Сейчас калориметрия чаще всего используется
для регистрации фазовых переходов или для изучения влияния на них
внутренних и внешних параметров (например, длины жирнокислотного
"хвоста", содержания холестерола, ионной силы, концентрации Са2+ и т.
д.). На рис. 8.5 приведен классический пример влияния длины
жирнокислотного "хвоста" липидной молекулы на температуру двух фазовых
переходов, определяемую методом ДСК. Следует отметить, что в липидных
смесях с сильно гетерогенным составом жирных кислот или высоким
содержанием холестерола фазовые переходы уширяются, что затрудняет их
калориметрическую регистрацию [37-39].
Биофизические подходы
355
3.1.2. Рентгеновское и нейтронное рассеяние
Эти методы позволяют надежно регистрировать фазовые переходы, поскольку
картина рассеяния в значительной степени зависит от конфигурации полярной
головки и жирнокислотного хвоста. Однако они больше подходят для
детального исследования конфигурации липидов, чем для простой регистрации
фазовых переходов (см. ниже).
